Pcr En Tiempo Real

EJERCICIOS BIOLOGÍA MOLECULAR:
PRINCIPIOS DE PCR EN TIEMPO REAL
DRA. ARIADNA GONZÁLEZ DEL ÁNGEL
DR. MIGUEL ANGEL ALCÁNTARA ORTIGOZA

PCR EN TIEMPO REAL
La reacción en cadena de la polimerasa o PCR hoy por hoy, se considera la piedra angular del diagnóstico molecular en Medicina. En tiempos recientes se han implementado diversas innovaciones y mejoras a la técnica original que amplificamillones de veces una secuencia blanco de DNA descrita inicialmente por K. Mullis. Particular interés reviste la modalidad de PCR en tiempo real que es una metodología ultrasensible, más rápida, menos laboriosa (NO REQUIERE ELECTROFORESIS) y que además es el estándar actual para realizar una cuantificación PRECISA de DNA (cuatificación relativa: órdenes de magnitud o cuatificación absoluta: númerode copias de DNA blanco iniciales al inicio de la reacción y por ende en una muestra biológica).

APLICACIONES DE LA PCR EN TIEMPO REAL EN EL DX MÉDICO:
La PCR en tiempo real es un método diagnóstico ideal en varias disciplinas de la medicina:

* Infectología: Método muy preciso y estándar de referencia para cuantificar el número de copias de genomas virales circulantes como parámetro derespuesta a tratamiento (HIV, virus de hepatitis B y C).
* Método diagnóstico de certeza para el diagnóstico infectológico y bioterrorismo (Influenza A H1N1, menongoencefalitis virales, contaminación fecal de alimentos, antrax).
* Oncología: Cuantificación absoluta de transcritos o mRNA’s quiméricos derivados de translocaciones responsables de leucemias o linfomas como un parámetro derespuesta al tratamiento antineoplásico o supervivencia libre de enfermedad (BCR/ABL en leucemia mieloide crónica).
* Genética Médica:
* Caracterización por ensayo de DISCRIMINACIÓN ALÉLICA a gran escala en un número grande de muestras como podría ser en gotas de sangre seca de tamiz neonatal ampliado, de mutaciones específicas (puntuales, microinserciones/microdeleciones) responsables detrastornos mendelianos o monogénicos.

* Diagnóstico de DELECIONES O DUPLICACIONES GRANDES por evaluación de dosis génica (cuantificación de DNA relativa) responsables de padecimientos:
* Autosómico dominantes
* Deleciones grandes en genes BRCA1 en síndromes de cáncer de mama y ovárico familiar = El método distingue la presencia de 1 copia de BRCA1 íntegra por genoma diploide enpacientes y 2 copias en individuos no afectados. Las deleciones grandes en BRCA1 responsables de Ca de mama y ovario familiar, dependiendo de la población analizada pueden llegar a conformar el 10% de las mutaciones patogénicas.
* Duplicaciones del gen PMP22 en la neuropatía periférica más frecuente del humano o Charcot-Marie-Tooth tipo 1ª, donde los pacientes presentan tres copias para elgen por genoma diploide.
* Autosómico recesivos:
* Pacientes heterocigotos compuestos con fibrosis quística que presentan una mutación pequeña (puntual o microdeleción como la delta-F508 y una deleción grande que elimina grandes extensiones del gen CFTR (<2% de los casos). La técnica además podría distinguir a los individuos portadores de la deleción asíntomaticos (1 copia por genomadiploide) de aquellos no portadores (2 copias por genoma diploide).
* Ligadas al cromosoma X:
* Diagnóstico de mujeres portadoras de deleciones parciales intragénicas que eliminan uno a varios exones del gen DMD y que no pueden ser identificadas a través del estudio de PCR múltiple convencional útil en varones, debido a que las mujeres presentan al menos un alelo DMD íntegro. Así elPCR en tiempo real por cuantificación relativa, permite distinguir a las mujeres portadoras que muestran 1 copia por genoma diploide de las no portadoras que presentan dos copias por genoma diploide.

FUNDAMENTO METODOLÓGICO
La técnica de PCR en tiempo real (PCR-TR) en la modalidad “5’-exonucleasa” o ensayo TaqMan consiste, además del empleo de todos los componentes de la típica PCR incluyendo...