Pcr Metodos

INTRODUCCIÓN
El objetivo de las prácticas es identificar un cDNA problema (de unas 880 pares de bases) y expresarlo en células humanas.
Para ello, se va a amplificar un fragmento de DNA clonado enun plásmido, para generar nuevas dianas de restricción para subclonarlo en plásmidos de nuestro interés. La amplificación se realiza con oligonucleótidos específicos, complementarios del cDNA deinterés. A estos se les ha añadido una secuencia adicional de 14 (oligo P1 con sentido) nucleótidos y 12 nucleótidos (oligo P2 antisentido) que contienen los 6 nts que determinan las dianas de restricciónde Hind III y Bam HI. El fragmento amplificado obtenido se digerirá con Hind III y Bam HI con el fin de poder clonarlo posteriormente en los sitios Hind III y Bam HI del pEGFP-C1.
Una vez clonado,se transfectarán células HeLa humanas y se observará la transfección mediante tinción con Hoechst en el microscopio de fluorescencia.

Día 1 (12/03/2012)
Amplificación de fragmentos de DNA por latécnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Preparación, amplificación del plásmido pEGFP-C1




Figura 1. Representación del plásmido pEGFP – C1 y los lugares de restricción de lasenzimas Hind III y BamH I
El plásmido codifica para β-lactamasas, que pueden “neutralizar” el antibiótico kanamicina. Por tanto, las bacterias con el plásmido insertado crecerán en un medio conkanamicina.


Preparación de las bacterias
Se selecciona una colonia de bacterias E. coli que contiene el plásmido con resistencia a kanamicina y se añade a un tubo estéril con LB (medio de LuriaBertani) con kanamicina. Se deja crecer las bacterias a 37° C en un baño de aire durante toda la noche.
PCR, reacción en cadena de la polimerasa
La PCR es la reacción en cadena de la polimerasa, unatécnica que se utiliza para amplificar un número de copias de un fragmento de DNA para generar millones de copias de éste.
Preparamos 3 tubos de PCR conteniendo 48 µl del mix: tampón PCR 10x,...