PCR tiempo real

¿Por qué
se
desarrolló
la PCR en
tiempo
real?

La identificación de la expresión genética y de
secuencias específicas de ADN o ARN es un factor
crucial cuando se trabaja con técnicas de biología
molecular.

La eficacia de amplificación de la PCR convencional
va disminuyendo con el tiempo, hasta que la
reacción llega a una fase de saturación en la que
ya no se produce incremento de ADN.

PCRconvencion
al Vs PCR
en Tiempo
Real

PCR
convencion
al Vs PCR
en Tiempo
Real

En el mismo instrumento se pueden llevar a cabo ensayos
cualitativos, cuantitativos. sustituyendo a los pasos de
amplificación, electroforesis y análisis de imagen de una PCR
tradicional.

En la PCR a tiempo real, los procesos de amplificación y
detección se producen de manera simultánea en el
mismo vial cerrado.

PCRTIEMPO
REAL
FUNDAMEN
TO

Mediante detección por fluorescencia se puede medir
durante la amplificación la cantidad de ADN sintetizado
en cada momento, ya que la emisión de fluorescencia
producida en la reacción es proporcional a la cantidad de
ADN formado.

Esto permite conocer y registraren todo momento la
cinética de la reacción de amplificación.

ADN molde

Buffer

SISTEMAS DE
DETECCIÓN PORFLOURESCENCIA

dNTPs

Polimerasa
Marcadores
fluorescentes

Primers

MARCADORES
FLOURESCENTES

ESPECÍFICOS

SISTEMAS DE
DETECCIÓN POR
FLOURESCENCIA

NO ESPECÍFICOS

Q

SONDAS
Y

PRIMERS

AGENTES
INTERCALANTES

S

OND

AS

Mecanismo de FRET

SISTEMAS DE

Q

Q
R

DETECCIÓN POR
FLOURESCENCIA

R

R

Q

R

QQuencher/ Aceptor Energía
Reportero
flourescente/Donador
R

S

OND

AS

Sonda
Sonda

Sondas FRETSISTEMAS DE
DETECCIÓN POR
FLOURESCENCIA

5’

3’
5’

3’

Prime
r

Sondasonda
5’

3’
5’

3’
Prime
r

3’
5’

Prime
r

5’
3’
Prime
r

Sonda

3’
5’

Sonda

Prime
r

5’
3’
Prime
r

S

OND

AS

Sondas Taqman

SISTEMAS DE
DETECCIÓN POR
FLOURESCENCIA

S

OND

AS

Sondas beacons

SISTEMAS DE
DETECCIÓN POR
FLOURESCENCIA

Parecidas a Taqman.
Molécula donadora (5’).
Molécula Aceptadora (3’).
Fluorescenciareversible en
comparación con Taqman.

S

OND

AS

Molecular Beacons

SISTEMAS DE
DETECCIÓN POR
FLOURESCENCIA

Mecanismo de acción intracelular.
Bloqueo de PCR, Evita que continúe
la amplificación a lo largo de la
sonda.
Cinéticamente favorable y
altamente efectiva.

Se Visualizan mediante la técnica de
electroforesis.
Reconocen secuencias blanco en el ADN
molde
Proporciona un extremo 3’.
EnlaceFosfodiéster.
Extremo 3’OH

PRIMERS

Sentido y Anti-sentido.

Se basa en el aumento de
temperatura creciente.

ANÁLISIS
DE CURVAS
DE
DISOCIACIÓ
N

Temperatura de fusión (Tm)

Hibridación entre Sonda y ADN
salvaje.

Hibridación entre sonda y ADN
mutado.

Enfermedad de Huntington
causada por un número
expandido de repeticiones CAG.

Agentes intercalantes
• Son fluorocromos que aumentan notablemente laemisión de fluorescencia cuando
se unen a ADN de doble hélice.

Utilización de
colorantes

El colorante se une
al ácido nucleído

Emite una señal
fluorescente que se
procesa en tiempo
real

Un aumento del producto de la PCR conduce a un aumento de la
fluorescencia detectada en cada ciclo de la PCR

Ventajas
La optimización de las condiciones de la
reacción es muy fácil
Es más barato que lassondas
específicas
Son distribuidos por los proveedores de
reactivos listos para usar
No requieren un diseño experimental
adicional

Desventaj
as
Su baja especificidad.
Se unen de manera indistintiva.
No permiten la identificación de
polimorfismos en la secuencia diana.

SYBR ® Green
• Es muy utilizado por su bajo costo
Su uso implica un diseño muy cuidadoso
de los primers con el fin de evitar laformación de dímeros.

Se une al surco menor del ADN de doble cadena

La unión, al ser inespecífica, será a lo largo de toda la molécula de ADN de
doble cadena, incluyendo los dímeros de primer que pudieran formarse.

La señal de fluorescencia incrementa de manera
proporcional a las moléculas de doble cadena
producidas en la amplificación

Se considera un
método de
cuantificación menos
preciso que...