Pcr Y Secuenciacion
Páginas: 8 (1996 palabras)
Publicado: 26 de septiembre de 2012
PCR YSECUENCIACION EN TIEMPO REAL
INTRODUCCION
El PCR en tiempo real es una modificación de la PCR que se puede utilizar para determinar cuantitativamente la cantidad inicial de ácidos nucleicos. En este procedimiento la reacción de PCR habitual se utiliza para amplificar un fragmento de DNA determinado, y un instrumento sensible determina exactamente la cantidad de DNA presente en lasolución después de cada ciclo. Con frecuencia se utiliza en la reacción una sonda que posee fluorescencia y que es específica para la secuencia de DNA de interés. La técnica se denomina PCR en tiempo real porque la cantidad de DNA amplificado se determina medida que la reacción se produce. A menudo la PCR en tiempo real se combina con la PCR de la transcripción inversa para medir la cantidad demRNA en una muestra, lo que permite a los biólogos determinar el nivel de expresión de un gen en diferentes células y bajo diferentes condiciones.
Las técnicas de secuenciación están basadas en procedimientos de electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizantes de alta resolución (llamados geles de secuenciación), los cuales son capaces de resolver cadenas sencillas deoligonunucleotidos con longitudes de entre 300 bases hasta 1000 bases que difieren en tamaño por solamente un deoxinucleotido. En la forma práctica para determinar la secuencia de una región de ADN, se generan cuatro reacciones químicas o enzimáticas separadas, un conjunto de oligonucleótidos marcados de cadena sencilla los cuales empiezan en el mismo extremo fija, y difieren en longitud unos de otros porúnicamente una base sucesiva en la secuenciación.
De este modo la primera de las cuatro reacciones generadas, contienen a todos los oligonucleótidos de diferente longitud que terminan en el deoxinucleotido G, la segunda reacción contiene los que terminan en A, la tercera a los que terminan en T t la cuarta a los que terminan en C. Los deoxinucleoticos producidos en las cuatro reacciones se resuelvenbajo condiciones desnaturalizantes en carriles adyacentes de un gel de secuenciación.
Resumen
La identificación de la expresión genética y de secuencias específicas de ADN o ARN es un factor crucial cuando se trabaja con técnicas de biología molecular. Para obtener esta información algunas pruebas han sido desarrolladas, siendo la PCR una de las más usadas. Sin embargo esta técnica tienealgunas limitaciones como la dificultad de cuantificar el producto de la PCR y el riesgo de provocar contaminación en el laboratorio. Para hacer frente a estas desventajas, la PCR en tiempo real ha sido desarrollada. (1)
Esta técnica brinda una gran cantidad de datos con una alta sensibilidad y especificidad usando plataformas modernas que evitan la contaminación que puede ser causada enlaboratorio por ácido nucleídos. Por otro lado algunas consideraciones como el escoger la estrategia de cuantificación y marcadores fluorescentes, así como la interpretación de los datos obtenidos, deben ser tomadas en cuenta cuando se usa la PCR en tiempo real. En este artículo se revisan los conceptos básicos de la PCR en tiempo real y del manejo de los datos obtenidos con esta técnica de laboratorio.(2)
Aplicaciones de la PCR en tiempo real.
La PCR en tiempo real tiene amplias aplicaciones en investigación científica y como herramienta de diagnóstico. Vale la pena resaltar que se han hecho grandes logros en el estudio de virus que afectan al hombre y a los animales así como en la investigación de bacterias y hongos patogénicos, pues esta prueba ofrece una gran sensibilidad yespecificidad en menor tiempo y a un menor costo. También es ampliamente utilizada en identificar mutaciones o polimorfismos genéticos valiéndose de sondas específicas y sus resultados en el análisis de los cambios de la curva de fusión (3).
Sin embargo uno de los campos de mayor aplicación de esta técnica es la investigación de cambios en la expresión genética de células a través de la cuantificación...
INTRODUCCION
El PCR en tiempo real es una modificación de la PCR que se puede utilizar para determinar cuantitativamente la cantidad inicial de ácidos nucleicos. En este procedimiento la reacción de PCR habitual se utiliza para amplificar un fragmento de DNA determinado, y un instrumento sensible determina exactamente la cantidad de DNA presente en lasolución después de cada ciclo. Con frecuencia se utiliza en la reacción una sonda que posee fluorescencia y que es específica para la secuencia de DNA de interés. La técnica se denomina PCR en tiempo real porque la cantidad de DNA amplificado se determina medida que la reacción se produce. A menudo la PCR en tiempo real se combina con la PCR de la transcripción inversa para medir la cantidad demRNA en una muestra, lo que permite a los biólogos determinar el nivel de expresión de un gen en diferentes células y bajo diferentes condiciones.
Las técnicas de secuenciación están basadas en procedimientos de electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizantes de alta resolución (llamados geles de secuenciación), los cuales son capaces de resolver cadenas sencillas deoligonunucleotidos con longitudes de entre 300 bases hasta 1000 bases que difieren en tamaño por solamente un deoxinucleotido. En la forma práctica para determinar la secuencia de una región de ADN, se generan cuatro reacciones químicas o enzimáticas separadas, un conjunto de oligonucleótidos marcados de cadena sencilla los cuales empiezan en el mismo extremo fija, y difieren en longitud unos de otros porúnicamente una base sucesiva en la secuenciación.
De este modo la primera de las cuatro reacciones generadas, contienen a todos los oligonucleótidos de diferente longitud que terminan en el deoxinucleotido G, la segunda reacción contiene los que terminan en A, la tercera a los que terminan en T t la cuarta a los que terminan en C. Los deoxinucleoticos producidos en las cuatro reacciones se resuelvenbajo condiciones desnaturalizantes en carriles adyacentes de un gel de secuenciación.
Resumen
La identificación de la expresión genética y de secuencias específicas de ADN o ARN es un factor crucial cuando se trabaja con técnicas de biología molecular. Para obtener esta información algunas pruebas han sido desarrolladas, siendo la PCR una de las más usadas. Sin embargo esta técnica tienealgunas limitaciones como la dificultad de cuantificar el producto de la PCR y el riesgo de provocar contaminación en el laboratorio. Para hacer frente a estas desventajas, la PCR en tiempo real ha sido desarrollada. (1)
Esta técnica brinda una gran cantidad de datos con una alta sensibilidad y especificidad usando plataformas modernas que evitan la contaminación que puede ser causada enlaboratorio por ácido nucleídos. Por otro lado algunas consideraciones como el escoger la estrategia de cuantificación y marcadores fluorescentes, así como la interpretación de los datos obtenidos, deben ser tomadas en cuenta cuando se usa la PCR en tiempo real. En este artículo se revisan los conceptos básicos de la PCR en tiempo real y del manejo de los datos obtenidos con esta técnica de laboratorio.(2)
Aplicaciones de la PCR en tiempo real.
La PCR en tiempo real tiene amplias aplicaciones en investigación científica y como herramienta de diagnóstico. Vale la pena resaltar que se han hecho grandes logros en el estudio de virus que afectan al hombre y a los animales así como en la investigación de bacterias y hongos patogénicos, pues esta prueba ofrece una gran sensibilidad yespecificidad en menor tiempo y a un menor costo. También es ampliamente utilizada en identificar mutaciones o polimorfismos genéticos valiéndose de sondas específicas y sus resultados en el análisis de los cambios de la curva de fusión (3).
Sin embargo uno de los campos de mayor aplicación de esta técnica es la investigación de cambios en la expresión genética de células a través de la cuantificación...
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