pdf PCR

PCR

Fundamento, Variantes y
Aplicaciones

MSc(c). Cristian Piscoche B., MT

PCR: Contenido
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Definición y desarrollo.
Base molecular.
Componentes
Etapas.
Equipamiento.
Procedimientos.
Ventajas y desventajas.
Aplicaciones.
Variantes: M-PCR, ASO-PCR, nPCR, Inmuno-PCR,
RFLP-PCR, RT-PCR, qPCR.
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PCR: Definición yDesarrollo
Método enzimático que permite la amplificación
exponencial in vitro de un fragmento específico de DNA.

Mullis (1983): Concepción de la idea de PCR.
Saiki (1985): 1ª publicación “aplicaciones” en Science.
Mullis (1987): Publicación “Teoria” en Met. of enzymology.
Mullis (1993): Premio novel de química.
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PCR: Base Molecular
ReplicaciónFisiológica del DNA

cadena
retrazada

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PCR: Resumen
95OC
45OC - 65OC

72OC

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PCR: Componentes
(Reactivos y equipos)

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PCR: Componentes
Agua grado molecular (H2O milli-Q):
• Libre de nucleasas.
• Desionizada a 18m-ohms.
• Purificada por UV y ozono.
•Pentadestilada.
Solución amortiguadora (Buffer):
• Mantiene pH óptimo para que la enzima actúe.
• Generalmente: 10X. (Tris-HCl, KCl, MgCl2)
Catión divalente:
• Estimula a la Polimerasa a incorporar los dNTP´s.
• Efecto en especificidad y rendimiento.

• Generalmente: 0.5 - 2.5 mM. (MgCl2 o MnCl2)
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PCR: Componentes
Desoxinucleótidos (dNTP´s):
• Son 4 típicos:dATP, dCTP, dGTP, dTTP.
• Se incorporan al molde por complementariedad.
• Afecta especificidad y fidelidad.
• Generalmente: 0.2 - 1.0 mM.

Oligonucleótidos iniciadores (Primers):
• Secuencias cortas conocidas de DNA.
• Moléculas lineales con un OH en el extremo 3’
• Reconocen secuencias específicas en el target.
• Definen la región a amplificar.
• Requieren de diseño cuidadoso.
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Diseño de Primers
• Usa softwares bioinformáticos:
Primer3, Primer premier,…
• Diferentes parámetros:
-Evitar dimeros: no complementarios entre si en mas de 4 b.

-Longitud: 18 - 30 b.
-Contenido de G+C: 40 - 60%.
-Extremo 3’ adecuado: C, G, GG, CC o GC.
-Tm adecuado: 50 – 70 ºC (diferencia
Cálculo de Tm (fórmula de Wallace):

max. 5 ºC entre ambospares).

Tm = 4ºC(G+C) + 2ºC(A+T)

Diferenciar Tm de Th.
Tº de melting (Tm): temperatura en la que el 50% de los dsDNA están desnaturalizados.
Tº de hibridación (Th): Por lo general Th debe ser 5ºC menor que la Tm.
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PCR: Componentes
DNA molde (Template):
• Puede ser ssDNA o dsDNA.
• cDNA levemente menos efectivo.

DNA Polimerasa termoestable:
•Enzima que realiza la síntesis de DNA.
• Soporta múltiples ciclos catalíticos.
• Inicia síntesis sólo a partir de 3’ OH libre, nunca a partir
de nucleótidos simples libres.
• Más usados:
Taq Thermus aquaticus (estabilidad: 9’ a 97°C)
Pwo Pyrococcus woesei (estabilidad: 2h a 100°C)
Pfu Pyrococcus furiosus (Alta fidelidad)
rTth Thermus thermophilus (Alta fidelidad y RT-PCR)
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DNA Polimerasa Termoestable
Diferencias entre Taq y Pfu:
Parámetro
Termoestabilidad
Vel. de síntesis
(procesividad)
Exonucleasa 3’ – 5’
(proofreading)

Tasa de errores

Taq

Pfu

1h a 95ºC

Varias hs a 95ºC

2000 nt/min

500 nt/min

Ausente

Presente

1.1x10-4 sust/b

1.6x10-6 sust/b

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PCR:Equipamiento
Termociclador
• Equipo que permite calentar y enfriar los tubos de
reacción controlando la Tº necesaria para cada etapa.
• Se basa en el “efecto peltier”, que permite calentar y
enfriar los tubos invirtiendo la corriente eléctrica.
• Pta. un sistema que calienta la tapa de cierre para evitar
la condensación sobre los tubos de reacción.

Primeros modelos

Para PCR convencional...