plasmidos

TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS COMPETENTES DE Escherichia coli
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Zuluaga Andrade Liseth. Mejía villera Vanessa

RESUMEN
Para la transformación de las bacterias en este caso de E. Coli se utilizó el método de choque térmico para la introducción del plásmido resistente al antibiótico que este caso fue la ampicilina. Los resultadosesperados es que las bacterias crecieran en el medio de LB con ampicilina las cuales presentan un plásmido con el gen de resistencia, mientras que el que no tiene plásmido con gen de resistencia se deduce que no va a crecer. Así mismo se prepararon medios de cultivos es condiciones de asepsia para no alterar los resultados.
Palabras claves: plásmidos, choque térmico, LB. E. Coli.
INTRODUCCIÓN

Latransformación bacteriana ha tenido impacto sobre la genética bacteriana, fue uno de los primeros mecanismos descubiertos de intercambio genético entre bacterias. La palabra transformación se utiliza entonces para describir intercambio genético entre procariotas realizado por DNA.
Para que la transformación tenga lugar, la bacteria tiene que encontrarse en el estado llamado estado de competencia,que ocurre en determinadas condiciones fisiológicas; en este estado la bacteria presenta alteraciones en su pared y membranas celulares, que permiten la entrada de ácidos nucleicos en la célula. Hay diferentes tipos de transformaciones celulares. Todas las células que se encuentran en un estado en el que pueden ser transformadas por el DNA que está en un ambiente natural se dicen que soncompetentes.
Hay casos en el que las bacterias no se hacen competentes bajo condiciones ordinarias de cultivo en el cual se utilizan tratamientos artificiales, como exponer las células a elevadas concentraciones de cationes divalentes. Se han creado técnicas para incrementar la frecuencia de transformación en el laboratorio con el fin de introducir fragmentos particulares de DNA. Esta se da por muchastécnicas como shock térmico o con un campo eléctrico el cual vuelve las membranas más porosas y permeables al DNA y la eficiencia de la transformación puede incrementarse también mediante la utilización de concentraciones elevadas de DNA. Todas estas técnicas permiten la transformación de bacterias E. Coli que no son naturalmente competentes. El objetivo de esta práctica es transformar célulascompetentes de E. coli utilizando el plásmido pAMP, Luego identificar clones transformados a partir de marcadores como la ampicilina los cuales nos permitirán saber si esta bacterias aceptaron el inserto de DNA.
METODOLOGIA
A) Crecimiento de Escherinchia coli.
Un día antes se picó colonia de bacterias de una placa de Petri reciente y fue trasferida a un de medio LB. Se incubo a 37ºC durante todala noche. A la mañana siguiente, se inoculo 1 ml de medio LB con 500 micro L del cultivo anterior. Se incubo con fuerte agitación en baño a 37ºC por 30 min. Medio de cultivo y baño precalentados a 37ºC.
B) Preparación de células competentes.
Se deja enfriar el cultivo 5-10 min en hielo y transferir a un tubo Falcon estéril de 50 ml en frío. Recuperamos las bacterias por centrifugación(refrigerada) a 3000 rpm durante 10 min a 4ºC. Luego se Decanto el sobrenadante y dejo el tubo invertido sobre un papel absorbente durante 1 min con objeto de eliminar los restos de medio.
Se resuspendieron las bacterias en 1.5 ml de 0.1 M CaCl2 frío. Se Mezclo con suavidad, con ayuda de una pipeta, para no lisar las células. Después de unos 20 min en hielo, se recuperaron las bacterias por centrifugacióna 3000 rpm durante 10 min a 4ºC, y se decantó de nuevo el sobrenadante como antes. Se Resuspenden las bacterias en 0.5 ml de 0.1 M CaCl2 frío y mantener en hielo.
2) Transformación de células competentes
Marcamos dos tubos falcón de 15 ml uno como plásmido + y otro como plásmido- conteniendo cada uno 1 ml de medio de cultivo con células competentes. Se Adiciono 20 μl de ADN plasmídico...