Polimerasa reaccion chain

TEMA 18. TÉCNICAS DE PCR Y RT-PCR Y APLICACIONES. PCR EN TIEMPO REAL. VENTAJAS

INTRODUCCIÓN
PROCESO DE HIBRIDACIÓN
Formación y separación de la doble hebra de ADN
Medio de hibridación

DISEÑO DE LOS MÉTODOS DE HIBRIDACIÓN
Preparación de las sondas: producción y marcaje
Producción de sondas
Tipos de marcaje
Inmovilización de la muestra
Hibridación ylavados
Cuantificación

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA: PCR
Fundamento de la PCR
Diseño de las técnicas de PCR
Medio de reacción
Etapas de la PCR
Visualizaci6n los productos
RT-PCR
qPCR O PCR CUATITATIVA
APLICACIONES DE LA PCR

OTRAS TECNICAS DE AMPLIFICACION DE SEÑAL Y ADN RAMIFICADO

INTRODUCCIÓN

Losácidos nucleicos difieren entre sí, principalmente, en la secuencia de nucleótidos, por lo que se han desarrollado técnicas capaces de determinar dicha secuencia o parte de ella. El principio de estas técnicas se fundamenta en el proceso de formación de la doble hélice del ADN, ya que las dos hebras de ADN se unen por el establecimiento de puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas (vercapítulo 20). La complementariedad de bases entre dos secuencias de ADN permite que se forme la doble hélice (Figura 21.1). Si se consigue sintetizar en el laboratorio un fragmento de ADN con una secuencia de bases complementaria a un segmento determinado de un ácido nucleico, puede utilizarse este fragmento (conocido con el nombre de sonda) para realizar un reconocimiento específico del ADN que quiereestudiarse. Este proceso de reconocimiento requiere un sistema que posteriormente permita la visualización o cuantificación de la unión entre el ácido nucleico a estudiar y la sonda. El proceso de reconocimiento y unión de un ácido nucleico y un fragmento complementario se conoce con el nombre de hibridación.
Uno de los problemas más importantes en el estudio de los ácidos nucleicos sueleser el hecho de no disponer de cantidad suficiente de muestra de ácidos nucleicos como para ser detectada. En este sentido, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que combina técnicas enzimáticas con técnicas de hibridación, permite amplificar la cantidad de ADN muestra y así facilita el estudio de los ácidos nucleicos cuando se dispone de muy poca muestra de partida.

[pic]
Figura 21.1.Estructura de la doble hebra de ADN. Se estabiliza por el establecimiento de puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas del interior de la doble hebra.

PROCESO DE HIBRIDACIÓN

Como ya se ha comentado, el fundamento de las técnicas de hibridación se encuentra en la complementariedad de las bases nitrogenadas, al establecerse puentes de hidrógeno entre la adenina y la timina (dospuentes de hidrógeno) y la citosina y la guanina (tres puentes).

Formación y separación de la doble hebra de ADN

Tanto la formación de la doble hélice de ADN, como la separación de las dos hebras (su desnaturalización), se encuentran influenciadas por la temperatura. En la figura 21.2 se puede ver cómo se produce el proceso de desnaturalización del ADN en función de la temperatura,representando la absorción de luz u.v. a 260 nm (máximo de absorción de los ácidos nucleicos). Esta absorbancia es un indicador del estado de desnaturalización del ADN, puesto que tiene mayor capacidad de absorbancia si está desnaturalizado (formando hebras simples) que si está en estado bicatenario. El proceso de formación de la doble hebra de ADN por el establecimiento de los enlaces de hidrógeno escooperativo. La forma sigmoidea de la curva indica que las interacciones entre los pares de bases unidas mediante puentes de hidrógeno y apiladas son interacciones cooperativas. Estas interacciones cooperativas se distorsionan progresivamente durante la desnaturalización (fusión) hasta que las dos hebras se separan completamente y, a partir de ese momento, no se observa ningún cambio...