Polimerasa

AMPLIFICACION POR REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
OBJETIVOS:
Conocer los fundamentos de la técnica de PCR, así como su importancia y su alcance en la Biología Molecular.
INTRUCCION
La invención de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por K. Mullis y sus colaboradores en 1985 ha revolucionado la biología molecular y la medicina molecular (Saiki et al., 1985). La reacción encadena de la polimerasa es una técnica in vitro utilizada para amplificar enzimáticamente una región determinada de ADN situada entre dos regiones de ADN cuya secuencia se conoce. Mientras que antes solo podían obtenerse cantidades mínimas de un gen específico, ahora incluso un único ejemplar de un gen puede amplificarse con la PCR hasta un millón de ejemplares en tan solo unas pocas horas.
Lastécnicas de PCR se han hecho indispensables para muchos procedimientos comunes, como la clonación de fragmentos específicos de ADN, la detección e identificación de genes para diagnóstico y medicina legal, y en la investigación de modelos de expresión de los genes. Más recientemente, la PCR ha permitido la investigación de nuevos campos, como el control de la autenticidad de los alimentos, lapresencia de ADN modificado genéticamente y la contaminación microbiológica. Para comprender los principios de la PCR y sus aplicaciones, debe atenderse en primer lugar a la naturaleza de la molécula del ADN, por lo que en la sección siguiente se describen la estructura y la replicación del ADN.

Principios de la PCR
La PCR se basa en el mecanismo de la replicación in vivo del ADN: el ADNbicatenario se desenrolla y pasa a ADN monocatenario, se duplica y se vuelve a enrollar. Esta técnica consiste en ciclos repetitivos de:
• Desnaturalización del ADN por fusión a temperatura elevada, a fin de convertir el ADN bicatenario en ADN monocatenario;
• Unión (anillamiento) de dos oligonucleótidos, utilizados como cebadores, al ADN diana;
• Extensión de la cadena de ADN por adición denucleótidos a partir de los cebadores utilizando ADN polimerasa como catalizador, en presencia de iones Mg2+.

Los oligonucleótidos consisten normalmente en secuencias relativamente cortas, que son diferentes entre sí y complementarias de los sitios de reconocimiento que flanquean el segmento de ADN diana que debe amplificarse. Las fases de desnaturalización del ADN molde, anillamiento del cebador yextensión del cebador constituyen un «ciclo» del método de amplificación por PCR.








Tras cada ciclo, las hebras de ADN recién sintetizadas pueden servir de ADN molde para el ciclo siguiente. Como se indica en la figura 6, el producto principal de esta reacción exponencial es un segmento de ADN bicatenario cuyos extremos vienen definidos por los extremos 5’ de los oligonucleótidoscebadores y cuya longitud viene dada por la distancia entre los cebadores. Los productos de una primera ronda de amplificación efectiva son moléculas de ADN de diferentes tamaños, cuyas longitudes pueden superar la distancia entre los sitios de unión de los dos cebadores. En la segunda ronda, estas moléculas generan hebras de ADN de longitud definida que se acumulan de forma exponencial en rondasposteriores de amplificación y constituyen los productos dominantes de la reacción. Así, la amplificación, que es el número final de ejemplares de la secuencia diana, se expresa con la siguiente ecuación:
(2n-2n)x
donde n es el número de ciclos, 2n es el número de moléculas del primer producto obtenidas tras el primer ciclo y de los segundos productos obtenidos tras el segundo ciclo con longitudindefinida, x es el número de ejemplares del ADN molde original. Teóricamente, al cabo de 20 ciclos de PCR habrá una amplificación de 220 veces, suponiendo que cada ciclo tiene un rendimiento del 100 %. El rendimiento de una PCR varía de un ADN molde a otra y depende del grado de optimización que se haya conseguido.

Ilustración La amplificación exponencial del ADN mediante PCR.
El proceso...