Polymerase Chain Reaction

Guía práctica sobre la técnica de PCR 517

Capítulo 17

Guía práctica sobre la técnica de PCR
Laura Espinosa Asuar

PCR son las siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction o Reacción en Cadena de la Polimerasa. La idea básica de la técnica es sintetizar muchas veces un pedazo o fragmento de ADN utilizando una polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy elevadas, ya que proviene dela bacteria Thermus aquaticus que vive a altas temperaturas (79ºC a 85ºC), de ahí su nombre comercial más conocido: taq polimerasa. Cuando hacemos una reacción de PCR simulamos lo que sucede en una célula cuando se sintetiza el ADN y en el tubo se mezclan todos los ingredientes necesarios para hacerlo: la polimerasa, el ADN del organismo que queremos estudiar –donde se encuentra el fragmento quequeremos sintetizar– , los oligonucleótidos (llamados también primers, iniciadores, cebadores, “oligos”, etc.) necesarios para que se inicie la transcripción, dinucleótidos (dNTPs), y las condiciones para que la enzima trabaje adecuadamente (cierto pH, determinadas cantidades de magnesio en forma de MgCl2, KCl, y pueden necesitarse otras sales o reactivos, dependiendo de cada polimerasa). Estatécnica tan ingeniosa tiene muchísimas aplicaciones distintas y se ha convertido en una herramienta muy importante en la biología molecular; sus aplicaciones van desde la genética de poblaciones, evolución molecular y genómica hasta la medicina forense. ¿Pero cómo funciona el PCR? Supongamos que ya tenemos los tubos listos con todo lo necesario para que la síntesis del fragmento que nos interesa que selleve a cabo (taq polimerasa, dinucleótidos, ADN, agua, buffer con mag517

518 Las herramientas moleculares

nesio y otras sales, y oligonucleótidos). El siguiente paso es colocar los tubos en una máquina conocida como termociclador, que básicamente sirve para calentarlos o enfriarlos a temperaturas muy precisas. ¿Cómo es que se amplifica el (o los) fragmento(s) que queremos? Primero, parahacer más sencilla la explicación, vamos a suponer que esperamos un solo fragmento de un tamaño determinado, y lo que sucede es lo siguiente (ver el primer ciclo de la figura 1): el termociclador calienta o enfría los tubos a tres temperaturas distintas, que se repiten una y otra vez (lo que se llama los ciclos de reacción), la primera es a 95ºC (y a este paso se le llama desnaturalización) durantela cual las dobles cadenas del ADN se abren o desnaturalizan, quedando en forma de cadenas sencillas; después el termociclador ajusta la temperatura en un intervalo entre 40º y 60ºC (llamada de alineamiento), a esta temperatura se forman y se rompen constantemente los puentes de hidrógeno entre los oligonucleótidos y el ADN, y aquellas uniones más estables (las que son complementarias) duraránmayor tiempo, quedando los oligonucleótidos “alineados” formando una pequeña región de doble cadena. La polimerasa se une a este pequeño pedazo de ADN de doble cadena y comienza a copiar en sentido 5’ a 3’; al agregar unas bases más, los puentes de hidrógeno que se forman entre las bases estabilizan más la unión y el oligonucleótido permanece en este sitio para el siguiente paso. Después latemperatura sube a 72ºC (paso que se conoce como extensión), ya que 72ºC es la temperatura en la cual la polimerasa alcanza su máxima actividad, y continúa la síntesis de los fragmentos de ADN a partir de los oligonucleótidos que ya se habían alineado. En el primer ciclo, con estas tres temperaturas, se sintetizarán los primeros fragmentos a partir del ADN genómico. Estos primeros fragmentos no tendrán eltamaño esperado, serán un poco más grandes ya que la taq copiará hasta donde le sea posible, pero como veremos más adelante, se obtendrán en cantidades tan pequeñas que al final no podremos detectarlos. Después se repiten una vez más las tres temperaturas, pero en este segundo ciclo, los oligonucleótidos, además de unirse al ADN que pusimos al inicio, también se unirán a los fragmentos recién...