Práctica Bioquimica

REPORTE

PRACTICA N° 2
“Respiración mitocondrial”


OBJETIVO GENERAL.
Observar la respiración mitocondrial mediante un organismo celular llamado levadura.
OBJETIVOS PARTICULARES.
- Comprobar la reacción de la respiración mitocondrial con diferentes sustratos.
- Determinar experimentalmente los efectos de inhibidores y desacoplantes.
HIPOTESIS
Al introducir un inhibidor en la cadenarespiratoria de la levadura, impedirá el funcionamiento de la enzima sobre el sustrato y se verá afectada la funcionalidad mitocondrial de las células de la levadura.

MATERIAL Y EQUIPO

Material por grupo

1 Paquete de levadura en polvo (se compra en el supermercado o en la panadería).
1 Matraz Erlenmeyer o un vaso de precipitado de 1 litro.
1 Agitador magnético o mosca.
1Parrilla de agitación
4 Tubos de 50 ml para centrífuga
1 Centrífuga clínica
1 Balanza de dos platos
2 Vasos de precipitado de 50 ml
1 Pipeta Pasteur con bulbo
1 Agitador de vidrio.
2 Micropipetas de 10- 100 l con puntas de plástico
2 Micropipetas de 100- 1000 l con puntas de plástico
1 Probeta de 250 ml
1 Balanza granataria
Papel aluminio
Agua destiladaMaterial por equipo

1 Gradilla
6 Tubos de ensayo
1 Espectrofotómetro
2 Celdas para el espectro
1 Vaso de precipitado de 600ml
1 Piceta con agua
1 Pipeta graduada de 5 ml
1 Pipeta graduada de 10 ml
3 Pipetas graduadas de 1 ml
1 Palangana con hielo
1 Termómetro
1 Vortex
Papel higiénico
Papel aluminio

Reactivos

• MES (ácido2-[N-Morfolino]etensulfónico)
• Glucosa
• NaCN (Cianuro de sodio)
• Antimicina A
• MTT (bromuro de1-4,5-dimetiltetrazol-2-il-3,5-difeniltetrazolio)
• CCCP (m-clorofenilhidrazona carbonil cianuro)

Soluciones

• MES 0.1 M
• Glucosa 1 M
• NaCN 0.2 M **
• Antimicina A 2 mM**
• MTT 4mg/ ml **
• CCCP 10 M

** NOTA: El NaCN, la antimicina, el CCCP y el MTT sontóxicos, se deben manejar con extrema precaución.


PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

A. Ayuno del las levaduras

Este procedimiento deberá llevarse a cabo un día antes de realizar la práctica. La cantidad que se sugiere es suficiente para todo el grupo.

1. Agregar 750 ml de agua destilada a un matraz Erlenmeyer de 1 litro, junto con un agitador magnético (mosca).
2. Pesar 5 g de levadura(peso seco) y añadirlo al matraz con el agua.
3. Taparlo con papel aluminio, y dejarlo agitando a temperatura ambiente hasta el día siguiente.
NOTA: Asegúrese de que la parrilla de agitación esté prendida únicamente en el modo de “agitar” y no el de “calentar”.

B. Preparación de la levadura para el ensayo.

1. Este procedimiento se realiza por equipo
2. Tomar 500 ml de la suspensión delevaduras y centrifugarlos en una centrífuga clínica a 2,500 rpm por 5 min.
3. Tirar el sobrenadante y pesar el botón de levadura (peso húmedo). Anotar el peso húmedo. _________________
4. Según la cantidad que se obtenga del peso húmedo, resuspender en un volumen equivalente de ml de agua destilada. Por ejemplo, si la levadura pesó 9.3 g se resuspenderá en 9.3 ml de agua.
5. Anotarlo______________________


C. Ensayo de respiración mitocondrial de las levaduras.

1. Preparar los tubos según la siguiente tabla:
NOTA: Mantener los tubos en hielo mientras se están preparando.


BLANCO TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5
REACTIVO Levadura + agua Levadura + Glucosa Levadura + Glucosa
+ NaCN Levadura + Glucosa
+ NaCN
+Antim. Levadura + Glucosa
+ CCCP.
MES 0.1M
(ml) -

0.5 ml0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
Glucosa 1M
(ml)
-
-
0.25
0.25
0.25
0.25
CCCP 10 M (l)
-
-
-
-
-
5
NaCN 0.2M
(l)
-
-
-
10
10
-
Antimicina-A 2mM (l)
-
-
-
-
25
-
MTT
4 mg/ml
(ml)
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
H2O (ml) 4.45 3.95 3.7 3.7 3.7 3.7
Levadura (l) 50 50 50 50 50 50

2. Tome en cuenta que el homogenado de...