Práctica oxígrafo

Práctica 3
Respiración en mitocondria de Germinado de Frijol Mungo

 
 
 
 
 
 
 

 
 
 

 

 
 
 
 
 
 

A) Aislamiento de Mitocondrias de Germinados de Frijol Mungo
1.Pesar 50g de germinados frescos de frijol mungo.
2. Macerar los germinados en una licuadora agregando 80ml de medio de
homogenización frío, macerar durante 8 segundos exactos.
3. Filtrar elmacerado a través de 8 capas de gasa.
4. Ajustar inmediatamente el pH del macerado a 7.4 agregando cuidadosamente
unos cristales de trizma base manteniendo sobre hielo el matraz con el
homogenizado.5. Centrifugar a 4 000 rpm durante 10 minutos a 4°C.
6. Recuperar los sobrenadantes.
7. Centrifugar nuevamente a 10 000 rpm durante 10 minutos a 4°C.
8. Decantar los sobrenadantes y resuspenderlas pastillas en 2ml de medio de lavado
frío, cada una. Una vez resuspendidas las pastillas calibrar los tubos agregando
medio de lavado hasta aproximadamente la mitad de su capacidad.
9.Centrifugar a 8 000 rpm durante 10 minutos a 4°C.
10. Decantar el sobrenadante y resuspender una de las pastillas en 0.5ml de medio de
lavado, con esta misma suspensión resuspenda la otra pastilla.Medio de Homogeneización:
Manitol 0.3M, EDTA 2mM, Albúmina Sérica de Bovino (BSA) 0.1%, Cisteína (Cis) 4mM,
PVP 40 0.1%, pH 7.4 (ajustado con Trizma – base)
Medio de Lavado:
Manitol 0.3M, EDTA 1mM,BSA 0.1%, pH 7.4 (ajustado con Trizma – base)
Medio de Reacción:
Manitol 0.3M, Cloruro de Potasio (KCl) 10mM, Fosfato Monobásico de Potasio (KH2PO4)
10 mM, Cloruro de Magnesio (MgCl2) 5 mM, pH7.4 (ajustado con KOH)

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Cada registro respiratorio se hará con un volumen de 60 l de la suspensión de
mitocondrias.

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Los alumnos deberán traer el germinado, lo más frescoposible.

Para la cuantificación de proteínas agregar 5 l de la suspensión de mitocondrias
en el tubo problema.

 
 
 
 
 
 
 

 
 
 
 
 
 
 

 
 
 
 
 
 
 
 

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