PRÁCTICA N

PRÁCTICA N°5
MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
Introducción
El crecimiento de una población microbiana o de un cultivo bacteriano se puede expresar en función del aumento de masa del cultivo (biomasa) y del aumento en el número de células. Por lo tanto, los métodos de medición se basan en la estimación de estas dos variables, a través de diversas técnicas que se clasifican en métodosdirectos e indirectos.
Entre los métodos directos se encuentra: la determinación del peso húmedo, determinación del peso seco, determinación del nitrógeno total o de otro componente característico, conteo en cámara de recuento de Neubauer y contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter). El método empleado depende de la naturaleza de la muestra. La determinación del peso seco es un métodomuy empleado principalmente en hongos y levaduras, o cultivos de alta densidad. Este consiste en filtrar la muestra, lavarla, secarla (105ºC, toda la noche) y pesarla. Esta medida representa aproximadamente el 10-15% del peso húmedo, que se realiza filtrando y pesando la muestra sin deshidratar. Sin embargo, debido a las características del proceso que se debe realizar, requiere mucho tiempo y sueleacarrear errores.
El conteo en cámara de Neubauer, consiste en el empleo de un portaobjetos especial con una graduación en la superficie, en la cual se dispensa la muestra, se deja reposar sobre la plataforma del microscopio durante unos minutos. Luego, se cuenta el número de células en varias celdillas y se calcula el número total. Este es un método muy rápido pero no distingue las células vivasde las no vivas, y se dificulta en el conteo de células muy pequeñas.
Por otro lado, entre los métodos indirectos se encuentran la medida de consumo de nutrientes o de producción de algún metabolito, el recuento sobre filtros y los más comúnmente usados el método turbidimétrico (ópticos) y el recuento de células viables en placas.
El método turbidimétrico se basa en la capacidad de las célulasmicrobianas de dispersar la luz que incide sobre ellas. Como el tamaño de las células de una poblaciones casi constante, el grado de dispersión es proporcional a la concentración de células presentes. Para ello se mide la turbidez en un espectrofotómetro, es un método relativamente rápido y sencillo. Un aspecto negativo de este método es que no se puede diferenciar la turbidez generada por célulasmuertas, por lo tanto no permite distinguir células viables de las no viables.
La técnica de conteo de placas, es la más empleada en microbiología, ya que permite contar sólo células viables. Esta consiste en hacer diluciones seriadas de un cultivo en medio líquido, sembrar cada una de las diluciones por extensión de superficie o siembra a profundidad en un medio específico y contar las coloniasque crezcan en las placas. El procedimiento se basa en la suposición que cada bacteria sembrada en la superficie del medio agarizado, se multiplicará y dará lugar a una colonia visible; en consecuencia, el número de colonias que se observará a simple vista o unidades formadoras de colonia (UFC) multiplicado por la dilución, representa al número de bacterias viables presentes en el cultivo original.El uso de esta técnica simultáneamente con el método turbidimétrica, permite obtener una estimación bastante precisa del número de bacterias de una muestra, e incluso hacer una curva de calibración para una especie y/o cepa determinada, cultivada a en un medio, condiciones y tiempo determinado. Y partiendo de unas condiciones particulares, de esta manera es posible describir el crecimiento de unacepa en el tiempo, deduciendo la curva de crecimiento para dicha especie. Esta técnica aplicada a muestras complejas, dará una estimación aproximada del número total de microorganismos, dependiendo del medio de cultivo utilizado, ya que no hay un medio y condiciones de incubación que favorezcan el crecimiento de todos los microorganismos. También pueden presentarse problemas relacionados con...