Prácticas metabolismo
Páginas: 17 (4180 palabras)
Publicado: 18 de enero de 2015
Nombre y apellidos: Eleonora Clemente Paci
Curso académico: 3º. Grupo: L5. Profesor/a: Sergi Puig.
Práctica 1. Isocitrato deshidrogenasa de levadura: un enzima
alostérico.
1. Calcular la concentración de los componentes de la mezcla de reacción e
indicar las condiciones que se han utilizado en el ensayo de actividad
enzimática respecto a la temperatura, pH y tiempos de reacción, en elcaso, por
ejemplo, del tubo 1 de la tabla del apartado 3.3.
Cálculo de las concentraciones: usaremos la fórmula Ci · Vi = Cf · Vf
•
Tris-HCl. !!!!!!30
•
NAD+.!!!!!!3
•
MgCl2.!!!!!!0,1
•
Isocitrato.
•
Extracto.
•
AMP.
!!"#
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45!
!
!
!!!1,5 · 10!! !! = !! !!!3 · 10!!! ! !! = !, !!!"
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!!!0,1 · 10!! !! = !! !!!3 · 10!!! !!!! = !, !!!" (apartado 3.4.)
La condiciones que se han utilizado en el ensayo son las siguientes:
- un pH neutro de 7,4 gracias al tampón Tris-HCl. Estopermite que no se
desnaturalice el enzima y que, por tanto, preserve su actividad.
- El MgCl2, el isocitrato y el AMP se tienen que conservar a -20ºC, mientras que
el NAD+ y el tampón Tris-HCl se conservan a -4ºC. Sin embargo los ensayos
enzimáticos se realizaron a temperatura ambiente, para que los enzimas
estuviesen activos.
- En cuanto a los tiempos de reacción, antes de añadir elsustrato (isocitrato) a la
mezcla de reacción, se dejaron pasar 15 minutos, porque como la muestra es
un extracto proteico en ella estarán presentes otras deshidrogenasas, y había
que dejar pasar ese tiempo para que gastaran todos sus sustratos y se
saturaran.
2. Determinación de la cantidad óptima de extracto enzimático.
Abs$340$nm$
!
Tiempo$(min)$
Dilución$1/10$
Dilución$1/4$Dilución$1/2$
0,5!
0,021!
0,032!
0,193!
1,0!
0,033!
0,057!
0,228!
1,5!
0,044!
0,082!
0,263!
2,0!
0,057!
0,110!
0,297!
2,5!
0,069!
0,136!
0,327!
3,0!
0,082!
0,162!
0,359!
3,5!
0,096!
0,188!
0,388!
4,0!
0,109!
0,215!
0,418!
4,5!
0,122!
0,240!
0,446!
5,0!
0,136!
0,264!
0,474!ΔA340/min$
0,025$
0,052$
0,062$
Cuanto más diluido está nuestro extracto enzimático más lenta es la reacción, y la
pendiente el la gráfica es menor. La dilución escogida para los posteriores ensayos
cinéticos es la de ¼. Esto es debido a que la dilución ½ tiene una velocidad demasiado
elevada, se gastan los sustratos demasiado rápido y se pierde la linealidad en la
curva. Por otro lado ladilución ! !" es demasiado lenta, y tardaríamos mucho en gastar
todos los sustratos y en que estos se convirtieran todos en productos.
Representaciones gráficas para los cálculos de velocidades iniciales a
diferentes cantidades de enzima. Poner los pies de figura.
Velocidades iniciales para distintas cantidades de enzima. Las gráficas representan las A340 frente al
tiempo en minutos, enel experimento SIN AMP. Gráfica A.1: 0,1 mL de citrato. Gráfica B.1: 0,15mL de
citrato. Gráfica C.1: 0,2mL de citrato. Gráfica D.1: 0,25mL de citrato. Gráfica E.1: 0,3mL de citrato.
Velocidades iniciales para distintas cantidades de enzima. Las gráficas representan las A340 frente al
tiempo en minutos, en el experimento CON AMP. Gráfica A.2: 0,1 mL de citrato. Gráfica B.2: 0,15mL decitrato. Gráfica C.2: 0,2mL de citrato. Gráfica D.2: 0,25mL de citrato. Gráfica E.2: 0,3mL de citrato.
3. Cinéticas en ausencia y en presencia de AMP
3.1. En ausencia de AMP
Sin AMP
[S] (D,L-isocitrato, mM)
Tiempo (min)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
ΔA340/min
0,1
0,143
0,148
0,155
0,164
0,167
0,174
0,185
0,192
0,196
0,014
0,15
0,195
0,199
0,208
0,217
0,225...
Curso académico: 3º. Grupo: L5. Profesor/a: Sergi Puig.
Práctica 1. Isocitrato deshidrogenasa de levadura: un enzima
alostérico.
1. Calcular la concentración de los componentes de la mezcla de reacción e
indicar las condiciones que se han utilizado en el ensayo de actividad
enzimática respecto a la temperatura, pH y tiempos de reacción, en elcaso, por
ejemplo, del tubo 1 de la tabla del apartado 3.3.
Cálculo de las concentraciones: usaremos la fórmula Ci · Vi = Cf · Vf
•
Tris-HCl. !!!!!!30
•
NAD+.!!!!!!3
•
MgCl2.!!!!!!0,1
•
Isocitrato.
•
Extracto.
•
AMP.
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La condiciones que se han utilizado en el ensayo son las siguientes:
- un pH neutro de 7,4 gracias al tampón Tris-HCl. Estopermite que no se
desnaturalice el enzima y que, por tanto, preserve su actividad.
- El MgCl2, el isocitrato y el AMP se tienen que conservar a -20ºC, mientras que
el NAD+ y el tampón Tris-HCl se conservan a -4ºC. Sin embargo los ensayos
enzimáticos se realizaron a temperatura ambiente, para que los enzimas
estuviesen activos.
- En cuanto a los tiempos de reacción, antes de añadir elsustrato (isocitrato) a la
mezcla de reacción, se dejaron pasar 15 minutos, porque como la muestra es
un extracto proteico en ella estarán presentes otras deshidrogenasas, y había
que dejar pasar ese tiempo para que gastaran todos sus sustratos y se
saturaran.
2. Determinación de la cantidad óptima de extracto enzimático.
Abs$340$nm$
!
Tiempo$(min)$
Dilución$1/10$
Dilución$1/4$Dilución$1/2$
0,5!
0,021!
0,032!
0,193!
1,0!
0,033!
0,057!
0,228!
1,5!
0,044!
0,082!
0,263!
2,0!
0,057!
0,110!
0,297!
2,5!
0,069!
0,136!
0,327!
3,0!
0,082!
0,162!
0,359!
3,5!
0,096!
0,188!
0,388!
4,0!
0,109!
0,215!
0,418!
4,5!
0,122!
0,240!
0,446!
5,0!
0,136!
0,264!
0,474!ΔA340/min$
0,025$
0,052$
0,062$
Cuanto más diluido está nuestro extracto enzimático más lenta es la reacción, y la
pendiente el la gráfica es menor. La dilución escogida para los posteriores ensayos
cinéticos es la de ¼. Esto es debido a que la dilución ½ tiene una velocidad demasiado
elevada, se gastan los sustratos demasiado rápido y se pierde la linealidad en la
curva. Por otro lado ladilución ! !" es demasiado lenta, y tardaríamos mucho en gastar
todos los sustratos y en que estos se convirtieran todos en productos.
Representaciones gráficas para los cálculos de velocidades iniciales a
diferentes cantidades de enzima. Poner los pies de figura.
Velocidades iniciales para distintas cantidades de enzima. Las gráficas representan las A340 frente al
tiempo en minutos, enel experimento SIN AMP. Gráfica A.1: 0,1 mL de citrato. Gráfica B.1: 0,15mL de
citrato. Gráfica C.1: 0,2mL de citrato. Gráfica D.1: 0,25mL de citrato. Gráfica E.1: 0,3mL de citrato.
Velocidades iniciales para distintas cantidades de enzima. Las gráficas representan las A340 frente al
tiempo en minutos, en el experimento CON AMP. Gráfica A.2: 0,1 mL de citrato. Gráfica B.2: 0,15mL decitrato. Gráfica C.2: 0,2mL de citrato. Gráfica D.2: 0,25mL de citrato. Gráfica E.2: 0,3mL de citrato.
3. Cinéticas en ausencia y en presencia de AMP
3.1. En ausencia de AMP
Sin AMP
[S] (D,L-isocitrato, mM)
Tiempo (min)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
ΔA340/min
0,1
0,143
0,148
0,155
0,164
0,167
0,174
0,185
0,192
0,196
0,014
0,15
0,195
0,199
0,208
0,217
0,225...
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