Práctico Cinética
Páginas: 5 (1083 palabras)
Publicado: 11 de noviembre de 2012
Universidad de Chile
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
Laboratorio Bioquímica 2012
CÁLCULO DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA.
1. INTRODUCCIÓN:
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especificidad de la enzima.
Laactividad enzimática refleja la capacidad de una enzima de transformar sustrato en producto en una unidad de tiempo.
Se define la unidad de actividad enzimática (U) como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto. La actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (U/mg prot) o por mililitro de disolución (U/ml).Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI) ha definido la unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se llama katal (kat). Como 1 mol son 106 µmoles y 1 minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal equivale a 60 x 106 U. Esta unidad es muy grande, de forma que se utilizan frecuentemente los submúltiplos como elmicrokatal (µkat, 10-6 kat) o el nanokatal (nkat, 10-9 kat).
Cuando se conoce el peso molecular de la enzima pura y el número de centros activos por molécula de enzima, las medidas de actividad enzimática permiten calcular el número de recambio de la enzima, o sea, el número de reacciones elementales que realiza la enzima por cada centro activo y por unidad de tiempo.
Gráfica de producto versus tiempo:Esta gráfica es la llamada curva de progreso de la reacción. Los datos nos permiten calcular la velocidad inicial (V0) de la reacción a partir de la pendiente de la curva de progreso a T0 considerando una concentración de sustrato constante.
En este trabajo práctico se calculará la actividad de la enzima Peroxidasa de Rábano. Esta enzima cataliza tanto reacciones cromogénicas comoquimioluminiscentes, dependiendo de los sustratos utilizados. La reacción consiste en la oxidación de diferentes compuestos dadores de hidrógeno a través de H2O2. El sustrato oxidable que utilizaremos en este trabajo práctico es el guayacol, que se oxida a un compuesto coloreado (color ladrillo) llamado tetraguayacol, el cual puede ser detectado a una longitud de onda de 470nm.
La reacción ocurre de lasiguiente manera:
La medición de la aparición de producto a 470 nm permite determinar a tiempos cortos la V0 con la cual se calculará posteriormente la actividad enzimática. La concentración de producto obtenido se puede determinar a partir de la ecuación de Lambert-Beer.
La Ley Lambert Beer es un medio matemático de expresar cómo la materia absorbe la luz. Esta ley afirma que la cantidad de luzque sale de una muestra es disminuida por tres fenómenos físicos: 1. La cantidad de material de absorción en su trayectoria (concentración) 2. La distancia que la luz debe atravesar a través de la muestra (distancia de la trayectoria óptica) 3. La probabilidad de que el fotón de esa amplitud particular de onda sea absorbido por el material (absorbancia o coeficiente de extinción)Estarelación puede ser expresada como: A = εbc |
Donde |
| A = | Absorbancia |
| ε = | Coeficiente molar de extinción (en este caso del Tetraguayacol) (M-1cm-1) |
| b = | Distancia en cm que atraviesa la luz (ancho de la cubeta= 1cm) |
| c = | Concentración molar |
|
2. OBJETIVOS:
-Determinar la actividad enzimática de la peroxidasa de rabanito en las condiciones de ensayo.-Realizar curvas de progreso con distintas concentraciones de enzima y sustrato constante.
3. REACTIVOS:
Extracto de rabanito diluido 1:25 (Mantener en hielo!!!)
Guayacol 1% (preparado en etanol 50%)
Peróxido de hidrógeno 1%
Agua destilada
4. MATERIALES:
Espectrofotómetro
Vórtex
Tubos de ensayo
Gradillas
Pipetas volumétricas de vidrio o micropipetas
Cubetas para espectrofotómetro (3...
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
Laboratorio Bioquímica 2012
CÁLCULO DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA.
1. INTRODUCCIÓN:
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especificidad de la enzima.
Laactividad enzimática refleja la capacidad de una enzima de transformar sustrato en producto en una unidad de tiempo.
Se define la unidad de actividad enzimática (U) como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto. La actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (U/mg prot) o por mililitro de disolución (U/ml).Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI) ha definido la unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se llama katal (kat). Como 1 mol son 106 µmoles y 1 minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal equivale a 60 x 106 U. Esta unidad es muy grande, de forma que se utilizan frecuentemente los submúltiplos como elmicrokatal (µkat, 10-6 kat) o el nanokatal (nkat, 10-9 kat).
Cuando se conoce el peso molecular de la enzima pura y el número de centros activos por molécula de enzima, las medidas de actividad enzimática permiten calcular el número de recambio de la enzima, o sea, el número de reacciones elementales que realiza la enzima por cada centro activo y por unidad de tiempo.
Gráfica de producto versus tiempo:Esta gráfica es la llamada curva de progreso de la reacción. Los datos nos permiten calcular la velocidad inicial (V0) de la reacción a partir de la pendiente de la curva de progreso a T0 considerando una concentración de sustrato constante.
En este trabajo práctico se calculará la actividad de la enzima Peroxidasa de Rábano. Esta enzima cataliza tanto reacciones cromogénicas comoquimioluminiscentes, dependiendo de los sustratos utilizados. La reacción consiste en la oxidación de diferentes compuestos dadores de hidrógeno a través de H2O2. El sustrato oxidable que utilizaremos en este trabajo práctico es el guayacol, que se oxida a un compuesto coloreado (color ladrillo) llamado tetraguayacol, el cual puede ser detectado a una longitud de onda de 470nm.
La reacción ocurre de lasiguiente manera:
La medición de la aparición de producto a 470 nm permite determinar a tiempos cortos la V0 con la cual se calculará posteriormente la actividad enzimática. La concentración de producto obtenido se puede determinar a partir de la ecuación de Lambert-Beer.
La Ley Lambert Beer es un medio matemático de expresar cómo la materia absorbe la luz. Esta ley afirma que la cantidad de luzque sale de una muestra es disminuida por tres fenómenos físicos: 1. La cantidad de material de absorción en su trayectoria (concentración) 2. La distancia que la luz debe atravesar a través de la muestra (distancia de la trayectoria óptica) 3. La probabilidad de que el fotón de esa amplitud particular de onda sea absorbido por el material (absorbancia o coeficiente de extinción)Estarelación puede ser expresada como: A = εbc |
Donde |
| A = | Absorbancia |
| ε = | Coeficiente molar de extinción (en este caso del Tetraguayacol) (M-1cm-1) |
| b = | Distancia en cm que atraviesa la luz (ancho de la cubeta= 1cm) |
| c = | Concentración molar |
|
2. OBJETIVOS:
-Determinar la actividad enzimática de la peroxidasa de rabanito en las condiciones de ensayo.-Realizar curvas de progreso con distintas concentraciones de enzima y sustrato constante.
3. REACTIVOS:
Extracto de rabanito diluido 1:25 (Mantener en hielo!!!)
Guayacol 1% (preparado en etanol 50%)
Peróxido de hidrógeno 1%
Agua destilada
4. MATERIALES:
Espectrofotómetro
Vórtex
Tubos de ensayo
Gradillas
Pipetas volumétricas de vidrio o micropipetas
Cubetas para espectrofotómetro (3...
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