Prática Polifenol Oxidasa

Práctica 1( Estudio cinético de la polifenoloxidasa

Objetivo:

1. Aprender el funcionamiento de una enzima

2. Determinar su actividad enzimática (polifenoloxidasa de la patata)

3. Extracción de la enzima de la patata

4. Determinación de Km y Vmax

5. El efecto de la concentración de la enzima sobre la actividad

6. Estudios de inhibición con agentes quelantes(azida)

Fundamento teórico:

Las enzimas tienen un papel fundamental: acelerar las reacciones biológicas actuando sobre sustratos específicos que se van a transformar en el producto de la reacción. Esta función es esencial para los seres vivos, la consiguen gracias a que poseen una estructura tridimensional característica, el centro activo, con un entorno químico adecuado que permite lainteracción entre la enzima y el sustrato mediante la formación de un complejo binario denominado complejo enzima-sustrato (ES). En las proteínas las características del centro activo van a estar determinadas por la naturaleza de los aminoácidos que lo forman y su distribución espacial concreta. En general, este proceso de formación del complejo ES se puede considerar un paso especifico de unainteracción molecular entre macromoléculas (en este caso proteínas) y moléculas de menor peso molecular, denominadas ligandos, y se realiza mediante la creación de interacciones no covalentes entre ambas moléculas.

La reacción enzimática general de transformación de un sustrato especifico en un producto se puede representar con la siguiente ecuación:

E + S K1K-1 ES K2 E + PUnión del sustrato Etapa catalítica

Pero hay que tener en cuenta que la transformación del sustrato a producto no es inmediata. Una vez que el sustrato adecuado interacciona con el centro activo se van a producir modificaciones que lo convierten en un estado de transición que se transformara en el producto final de la reacción.

Para entender cómo se realizan las interacciones en elcomplejo ES se han postulado varios modelos. El primero fue el denominado modelo “llave y cerradura” propuesto por Emil Fischer en 1894. En este modelo, las enzimas se consideraban estructuras rígidas complementarias a sus sustratos a los que se acoplaban de igual forma que lo hace una llave a una cerradura. Este modelo explica la especificidad entre enzima y sustrato, pero no permite explicar cómose producen la reacción de una forma eficiente.

La polifenoloxidasa principalmente se encuentra en fuentes vegetales, aunque también se localiza en el ser humano. Es una enzima que oxida algunos compuestos de los vegetales en presencia de oxigeno, actúa ennegreciendo el vegetal. Una de las formas de evitar este proceso seria escaldando el vegetal de tal manera que se desnaturaliza la enzima yal cambiar su estructura cambia su función.

En el ser humano la polifenoloxidasa se denomina tirosinasa y se localiza en la piel, los rayos ultravioleta activan esta enzima lo que produce más melanina y por eso nos bronceamos.

Materiales:

• Espectrofotómetro
• Tubos de ensayo
• Pipetas
• Propipetas
• Agua destilada
• Frasco lavador
• Batidora
• Papelde filtro
• Hielo
• Vasos precipitados
• Rejilla
• Embudo
• Dopa (sustrato)
• Disolución tampón fosfato sódico 0’02M
• Cronometro
• Micropipeta
• Azida (agente quelante)

Procedimiento:

1. Determinación de Km y Vmáx

• Preparación de la muestra: triturar la patata y filtrar la sustancia obtenida, con esta técnica de filtración conseguimosel extracto.

• Mantener en frio el extracto

• Limpiar el material (tubos, vasos, pipetas)

• Preparar los tubos con las sustancias, excepto el extracto que se añade en el último momento antes de la medición

|Nº Tubo |1 |2 |3 |4 |5 |...