pr cticas 3 y 4

PRÁCTICA 3
CUANTIFICACIÓN ESPECTROFOTOMETRICA DEL ADN

INTRODUCCIÓN
De manera general, después de extraer el ADN se verifica su concentración y calidad, así como
la posible contaminación por proteínas, sales o RNA. Para esto se utilizan diferentes metodologías
como la espectrofotometría y la electroforesis horizontal.
La espectrofotometría ultravioleta (UV) se utiliza para determinar la cantidadde ADN presente
en una muestra y estimar su pureza. Es útil, debido a que los ácidos nucleicos y las proteínas tienen
distinto espectro de absorción. Tanto el ADN como el RNA absorben la luz UV, con una absorción
máxima a 260 nm, lo que permite la cuantificación de moléculas a concentraciones tan bajas como 2
g/ml. Una solución de ADN de doble hebra pura, con una concentración de 50 g/ml tieneuna A260
(OD) de 1.0, mientras que 1 OD corresponde a 40 l/ml de ADN de cadena sencilla y a  20 g/ml
para oligonucleótidos de cadena sencilla. Este valor varía levemente dependiendo del contenido GC del
ADN, pero esta variación generalmente es mínima. Así, la concentración del ADN puede determinarse
aplicando una regla de tres a las lecturas obtenidas a partir de las muestras de DNA extraído(típicamente diluidas a 1/50 o 1/100).
En ésta práctica se utilizará un espectrofotómetro con luz UV para cuantificar y determinar la
pureza del ADN que fue aislado previamente. Esta información permitirá calcular la cantidad de ADN
que debe usarse en otras manipulaciones, como PCR o electroforesis.

ANTECEDENTES
1. ¿Cuál es el principio del funcionamiento de un espectrofotómetro UV/VIS?___________________________________________________________________________________
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2. ¿Qué significa el parámetro de densidad óptica (DO) de un compuesto?
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3. ¿Cómo se realiza una dilución 1:100 de un compuesto, y cómo calcula la concentración del mismo
compuesto partiendo de esa dilución? (el volumen final de la dilución debe ser 1 ml)
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OBJETIVO
 Calcular la cantidad de ADN presente en las muestras extraídas en las prácticas anteriores.
 Determinar la pureza del ADN obtenido anteriormente.
Notas preliminares al laboratorio
La determinación de absorbancia de una solución de ácidos nucleicos a longitudes de onda
diferentes de 260 nm, son útiles para caracterizar la pureza delos ácidos nucleicos extraídos.
Las proteínas absorben luz UV a 280 nm y la relación A260 : A280 de una solución de ADN se
utiliza como indicador de contaminación de proteínas u otras moléculas diferentes de los ácidos
nucléicos. La relación A260 : A280 de una preparación de ADN de doble hebra pura se encuentra
típicamente entre 1.7 y 2.0. Relaciones más altas se deben frecuentemente acontaminación, mientras
que relaciones menores pueden indicar la presencia de proteínas, en estos casos la determinación de la
cantidad de ácidos nucleicos no es adecuada.
Para medir las longitudes de onda en el rango ultravioleta (UV, 260 nm) se requiere de una
lámpara de deuterio, porque la lámpara de luz visible (tungsteno) no produce suficiente energía en esta
región del espectro electromagnético para...