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UNIVERSIDAD DE BURGOS
FACULTAD DE CIENCIAS
BIOLOGÍA MOLECULAR 2ºCyTA

71953298Y
Beatriz Cañibano Fraile

AISLAMIENTO DEL DNA GENÓMICO

Para aislar el DNA cromosómico de elevado peso molecular es necesario comenzar con un
proceso de lisis celular, donde se rompen paredes y membranas celulares con un potter u
homogeneizador en frío (se realizan en frío debido a que las enzimas a temperaturas bajastienen poca o ninguna actividad). Tras ello se requiere un proceso de purificación y
precipitación de sus ácidos nucleicos. Y finalmente es determinado y cuantificado el DNA con
el que se trabaje.

ETAPAS Y REACTIVOS.
-

Extracción: Para esto se realiza una homogenización en un medio tamponante
adecuado para la desnaturalización del DNA. Para el precseo de extracción del DNA se
utilizan una seriede reactivos:

o

PROTEINASA K: Es una serina proteasa de amplio espectro, utilizada para
digerir proteínas y eliminar la suciedad de las preparaciones de ácido nucleico.
La proteinasa K inactiva las nucleasas que de otro modo podrían degradar el
ADN o ARN durante la purificación. La enzima se actica en presencia de
productos como el SDS y la urea, también a partir agentes quelantes como el
EDTA.o

RNasas: rompen el RNA cuando están en contacto con el mg, de esta manera
añadimos EDTA y eliminamos el mg, de tal manera que las RNasas no actúan.

o

Acetato de sodio: Se trata de una sal que se utiliza en este proceso ya que
junto a un alcohol, como es el fenol: SEVAG, el DNA plasmídico puede
precipitarse de la solución al añadir ambos.

o

SDS: Actúa rompiendo enlaces no covalentes en lasproteínas y
desnaturalizándolas, provocando la pérdida de su conformación activa. Es
decir, que este reactivo se encarga de extraer los lípidos de membrana y
desnaturalizar las proteínas. Además, elimina los componentes que no son
ácidos nucleicos.

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Beatriz Cañibano Fraile

Tampón TE: (Tris-ClH 50mM pH:7.6/EDTA100mM) Se trata de un tampón para
solubilizar el DNA y proteger al mismo de la degradación.
Se conoce al Tris-EDTA como una disolución amortiguadora que es utilizado
para prevenir cambios drásticos del pH, y en este caso, la solución Tris/EDTA
mantiene el ADN en una solución con un rango de pH alrededor de 7.0 a 9.0.


EDTA: ácido etildiaminotetraacético, es utilizado como agente
quelante, ya quepuede formar un complejo combinándose con iones
metálicos en disolución y formar complejos no iónicos, solubles en
agua y cíclicos.

-

Purificación: este proceso se basa en eliminar todo aquello que no es ácido nucleico
mediante disolventes orgánicos (Fenol y SEVAG), ya que los ácidos nucleicos son muy
solubles en disolventes acuosos.
o

SEVAG: cloroformo/alcohol isoamílico. disolvente orgánico delípidos

y

desnaturalizante de proteínas, purifica eliminando los restos de fenol de la
fase acuosa.

-

Precipitación: Se trata de la última etapa del proceso, donde se puede, si los ácidos
nucleicos han precipitado correctamente, reconocer el DNA. EL DNA resultante será
analizado tanto de forma cuantitativa (espectrofotometría) como cualitativa
(electroforesis en gel de agarosa).

PROTOCOLOEXPERIMETAL

 LISIS CELULAR.
Se comienza triturando un trozo de hígado de rata junto con Tris-EDTA (3ml) en frío. Una vez
realizada la homogeneización con el potter, se vierten 300μl del resultado anterior en un tubo
de 1.5ml y se le añaden 20μl de SDS 10%, se agita suavemente (inversión), a esto se le añade
además 4μl de proteinasa K y se incuba durante 30minutos a 65°C en una estufa.

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Un vez transcurrido ese tiempo, se le añade tampón TE (150μl) y 50μl de acetato de sodio 3M
y se mezcla el resultado por inversión.

 EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL DNA.
Realizados los pasos anteriores, se añade 1 volumen de fenol: SEVAG y se agita durante dos
minutos por inversión.
En la realización de...