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UNIVERSIDAD DE BURGOS
FACULTAD DE CIENCIAS
BIOLOGÍA MOLECULAR 2ºCyTA

71953298Y
Beatriz Cañibano Fraile

TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS COMPETENTES.

INTRODUCCIÓN TEÓRICA.
Se trata de una técnica para introducir DNA plasmídico en una bacteria y usar esa bacteria para
ampliar el plásmido y así obtener gran cantidad de plásmido. La amplificación del DNA en
células bacterianas implica la transformación,donde las células deber hacerse competentes y
tras ellos son expuestas al DNA exógeno (amplificar un plásmido: mediante la introducción en
una bacteria y así tener más DNA plasmídico).

Se quiere transformar células de E. coli de la cepa DH1 (no resistentes a la ampicilina) con una
vector plasmídico (Amp) y tras realizar un cultivo, visualizar las transformaciones de las células
según suresistencia al antibiótico (ampicilina).
La transformación de estas células se medirá mediante la eficacia de transformación que
equivale al nº de células transformadas por g de DNA utilizado.

La cepa DH1 contiene mutaciones que inactivan la endonucleasa re restricción endógena
minimizando la degradación del DNA recombinante que se introducen en ellas, además, es
muy eficaz para la captación de vectoresplasmídicos. (Gloria Morcillo Ortega, 2013).
El método más sencillo y utilizado para la transformación de bacterias es el de cloruro de
calcio. Este método se basa en la observación de Mandel e Higa en 1970, donde describen que
la toma de DNA del bacteriófago I por células bacterianas se incrementa con la adición de
calcio, sin que hasta el momento se hubiese descrito su mecanismo exacto. (Castro,2005).

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Beatriz Cañibano Fraile

Hay diferentes formas de llevar a cabo el proceso de transformación. Constará de 3 pasos:

1. Preparar células competentes.

Para que se produzca la transformación es necesario disponer de DNA libre, principalmente de
doble cadena. Este se unirá a la célula mediante un receptor. Lacélula debe encontrarse en
estado de crecimiento y en unas condiciones determinadas que la hagan competente.
Lo que se pretende es que el DNA extraño se aproxime a la membrana de la célula. El DNA
tiene carga negativa, que debe ser anulada para que la aproximación tenga lugar, por ello se
introducirán sales con carga positiva.

2. Introducción de DNA.

Es aquí donde la célula se encuentra expuestafrente a DNA (extraño), el cual se introduce en
la célula. Para esto, se tienen que crear poros en la membrana de dicha célula. Los poros se
crearán debido a un proceso de contraste térmico (de ahí la utilización de hielo y estufa); es
por estos poros por lo que la introducción del DNA se puede llevar a cabo.

3. Selección células transformadas.

Tras este proceso, se obtienen dos tipos de bacteria,E.coli.
-

Transformadas.

-

no trasformadas.

Todas ellas crecerán en un medio de cultivo y finalmente serán seleccionadas aquellas
resistentes al antibiótico que se utilice (ampicilina).

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Beatriz Cañibano Fraile

MATERIAL.
-

Pipetas.

-

Tubos de 1.5ml (eppendorfs).

-

Placas de cultivo.
o

Medio LB. medio decultivo líquido utilizado de forma habitual para el
crecimiento bacteriano.

o



Peptona trípsica de caseína.



Extracto de levadura.



NaCl.

Medio LB + ampicilina.

-

Tubos de 15 y 50ml.

-

Baño a 42°C. Para crear el contraste térmico antes mencionado y así que puedan
aparecer esos poros en la membrana celular.

-

Asas de siembra.

-

Estufa.

-

Mechero Bunsen. Para crear condiciones deesterilidad y así no contaminar las
muestras.

REACTIVOS.
-

Tampón de transformación I. Tbf I.

-

Medio SOB. Medio de cultivo líquido utilizado para el crecimiento bacteriano en la
mutagénesis de inactivación de genes cromosómicos utilizando fragmentos de PCR.
(htt).

-

Tampón de transformación II. Tbf II. Funciona como basificador del medio ya que las
células y el plásmido tienen carga...