Prac De Mol

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE CIENCIAS

Curvas Estándar y Concentración

Montiel Rosas Esteban, Jimena Rivero Camacho, Jiménez Ávila Cindy Edith, Maya Bernal César Francisco, Sánchez González Dante

INTRODUCCIÓN

Se le denomina Curva estándar a la herramienta cuantitativa de la investigación que se emplea para trazar un método de análisis de datos, los cuales seutilizan para determinar la concentración de una sustancia, particularmente proteínas y DNA en ciertas sustancias.
Para realizar el análisis se necesita de una curva de referencia construida con cantidades conocidas de una sustancia que se utiliza para determinar la cantidad de esta sustancia (proteínas o DNA) presente en una muestra incógnita. Se calcula midiendo la absorbancia, densidad óptica,luminiscencia, fluorescencia o radioactividad (Day, 1989).
Ésta se construye a partir de una solución patrón de Albúmina Sérico Bovina a 10 mg/ml. Cada una de las concentraciones de las muestras se obtiene por la interpolación de valores de la absorbancia en la curva patrón. Se considera como tubo cero a uno con agua destilada y los reactivos, este funcionará como colorímetro para unaabsorbancia cero (Harrus, 2001).
Para realizar la cuantificación de la absorbancia se utiliza uno de los distintos métodos de cuantificación de proteínas.
En el método de Biuret Se mezcla 1 mL de la solución proteica con 4 mL de reactivo de biuret. Este reactivo incluye sulfato de cobre, hidróxido de sodio, tartrato de sodio y potasio que se utiliza para estabilizar el cobre en una solución alcalina. Semantiene la mezcla en reposo y se observa la absorbancia a 540 nm en un blanco. En caso de que la reacción no sea clara, se debe centrifugar previamente a la lectura de la absorbancia.
El método de Bradford tiene su fundamento en la fijación del colorante azul de coomassie en las proteínas lo cual provoca un cambo en la coloración de la mezcla, este cambio de color puede ser interpretado en elespectrofotómetro. Debido a que la fijación no es igual en todas las proteínas, esta prueba puede ser no muy homogénea en todos los resultados (Battaner, 1993).

MATERIALES Y MÉTODOS

Para realizar la curva estándar del agua utilizamos la opción 1 del manual , con la cual pesamos en la balanza analítica 3,6,9,12,15,18 y 21 µl de agua destilada utilizando un vidrio de reloj y una micropipeta paratomar la cantidad de agua indicada (Fig. 1) , buscando una equivalencia peso (g) – volumen (µl). Con los datos obtenidos se realizo la curva estándar mediante la ecuación de la recta donde los valores de µl representan X y el peso (g) Y en la grafica.

Fig. 1 .Pesado del agua destilada en la balanza analítica

Para realizar la curva estándar de la proteína por el método de Biuret seprepararon 7 tubos de ensaye a los cuales se les agrego con una pipeta de 5ml, BSA, NaCl , solución problema , y reactivo de Biuret de la siguiente manera :

Tabla 1. Preparación de tubos para curva de proteína por el método de Bradford.

|Tubo |1 |2 |3 |4 |5 |6 |7 |
|BSA | | | | | | | |
|mg/ml |0 |0.25|0.50 |0.75 |1.0 |1.25 | |
|NaCl | | | | | | | |
|(ml) |6 |5.75 |5.50 |5.25 |5.0 |4.75 |5.50 |
|Sol. | | | | | | |0.5 |
|Prob. | | | | | | | |
|Rtivo. | | | | | | | ||Biuret |4 |4 |4 |4 |4 |4 |4 |
|(ml) | | | | | | | |

El reactivo de Biuret se agrego al final a cada tubo y poco antes de hacer las lecturas en el espectrofotómetro. Se puede observar como los tubos cambian de color, de uno transparente a uno azul o violeta (fig.2).

Fig. 2 Tubos con el reactivo de...