Practica 1

Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Departamento de Bioquímica
Métodos Analíticos 2
Reporte de la Práctica No. 1

“Determinación de proteínas por el Método de Lowry”

Ramos Salazar Sayuri Anahí

Grupo: 8BM2

Fecha de entrega: 7-Diciembre -2011

PRACTICA No.1
Determinación de proteínas por el Método de Lowry.

OBJETIVOS
* Conocer conceptos básicosrelacionados con la espectrofotometría.
* Realizar una curva tipo para una cuantificación correcta.
* Aplicar un método estadístico para determinar si hay diferencia significativa.
* Aprender a utilizar correctamente el espectrofotómetro para unos resultados confiables.
* Comprender ventajas y desventajas sobre el Método aplicado.
PROCEDIMIENTO
Curva de calibración, Análisis estadístico y Efectode sustancias no proteicas en el Método de Lowry.

Preparar 6 tubos como lo indica la Tabla 1

Reposar 30 min a Tº ambiente

Leer a 590 mn

Preparar 10 tubos con 0,3 de proteina+0.2 RA+5.0 RC +0.5 RD.

Preparar 5 tubos con 0.3 ml de proteina + 0.1 de sol interferente +0.1 ml RA

RESULTADOS
Tabla 1.- Lecturas para la Curva de calibración de hemoglobina obtenidas mediante el Método de Lowry.
Tubo| Cantidad de proteína (µg) | A590 |
| | Serie A | Serie B |
1 | 25 | 0.091 | 0.048 |
2 | 50 | 0.145 | 0.159 |
3 | 70 | 0.202 | 0.179 |
4 | 100 | 0.269 | 0.237 |
5 | 125 | 0.329 | 0.281 |

Grafico 1.- Curva de calibración por el Método de Lowry.
El grafico se realizo con las cantidades de proteína utilizadas en (μg) y la Absorbancia obtenida mediante el espectrofotómetro, se tomaron doslecturas para obtener mayor precisión y exactitud en los resultados y también para poder hacer regresión lineal para así obtener una ecuación.
Tabla 2.- Replicas para el análisis estadístico.
Tubo | A590 | Cantidad de proteína (µg) |
1 | 0.160 | 59.83 |
2 | 0.206 | 79.83 |
3 | 0.185 | 70.70 |
4 | 0.162 | 60.70 |
5 | 0.175 | 66.35 |
6 | 0.209 | 81.13 |
7 | 0.163 | 61.13 |
8 | 0.202 |78.09 |
9 | 0.186 | 71.13 |
10 | 0.185 | 70.75 |

Tabla 3.- Valores de Promedio (x), desviación estándar (S), varianza (S2), coeficiente de variación (CV), y limites de confianza (μ).
X | 69.96 |
S | 7.96 |
S2 | 63.35 |
μ | 64.26 | 75.65 |
CV | 11.38 |

Nota. Todos los calculos realizados para obtener dichos datos se obtuvieron mediante Excel 2007.
Tabla 4.- Efecto de algunas sustancias noproteínicas en el Método de Lowry.
Tubo | Sustancia | A590 | Cantidad de proteína (µg) | Tipo de interferencia generada |
1 | Tris 1M, pH 7.0 | 0.174 | 65.91 | Sin Interferencia |
2 | Glicerol al 1% (v/v) | 0.225 | 88.09 | Positiva |
3 | Detergente comercial al 1% | 0.179 | 68.09 | Sin Interferencia |
4 | Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 1.0% | 0.203 | 78.52 | Positiva |
5 | Ácidotricloroacético (TCA) al 5% | 0.223 | 87.22 | Positiva |
referencia | Tubo 3 de la curva tipo |

Grafico 2.- Comparación de Interferencias de sustancias no proteínicas con respectó a la cantidad de proteína del tubo 3.

DISCUSIÓN
El Método de Lowry es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se le añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas,siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer.

Este método consta de dos etapas:

  1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructuratridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato.

  2)   La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre...