Practica 14 2007

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UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA
FACULTAD DE CIENCIAS Y FILOSOFIA
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA, BIOLOGIA MOLECULAR Y FARMACOLOGIA
CURSO: PRACTICAS DE LABORATORIO EN BIOQUIMICA
2007

UNIDAD 4: Purificación y cuantificación de lípidos de membrana
Profesor Responsable: Carla Gallo

Práctica #14: Separación e identificación de especies de Fosfolípidos
Las mezclas complejas de lípidos de membranase pueden separar por procedimientos
cromatográficos como la cromatografía de capa fina, también llamada TLC (Thin Layer
Chromatography). Este procedimiento, al igual que la extracción de lípidos, se basa en la polaridad
relativa de estas moléculas. Para la TLC se utiliza una matriz de un material insoluble y polar, como la
sílica gel (que es una forma de ácido silícico Si(OH)4), la cual esesparcida en una capa fina sobre un
soporte -que para el caso de separación de lípidos es generalmente vidrio-. Las muestras son
colocadas en el borde de la placa, que se encuentra en una cámara con un ambiente saturado del
vapor del solvente (ver figura). A medida que el solvente sube por la placa por capilaridad, va
arrastrando a los lípidos. Los lípidos polares se unirán fuertemente a la sílica,mientras que los lípidos
neutrales no serán retenidos. La separación ocurre por una interacción entre los lípidos y la sílica y su
solubilidad relativa en los solventes utilizados.
Los lípidos una vez separados pueden ser detectados en las placas de TLC mediante distintos
métodos de tinción. Las moléculas que actúan como reveladores reaccionan con diferentes
componentes de los lípidos, como los doblesenlaces de los ácidos grasos, el fósforo o los grupos
amino de la cabeza polar.
Las diferentes especies lipídicas son identificadas en base a su migración relativa en las placas, al
compararlos con muestras patrón que se incluyen en las corridas.

Cromatografía de Capa Fina (TLC) - Generalidades
Una placa de TLC consiste en una fase estacionaria (generalmente sílica) la cual es inmovilizada
sobreuna superficie plana (vidrio, metal, plástico). Las muestras, ya sea un líquido o un sólido
disuelto en un solvente volátil, son depositadas sobre la fase estacionaria. Los constituyentes de la
muestra pueden ser identificados corriendo en paralelo estándares.
Un lado de la placa se pone en contacto con el solvente contenido en un reservorio, y el solvente se
moverá hacia arriba de la placa poracción capilar. Cuando el frente del solvente alcanza el otro
extremo de la fase estacionaria, la placa es removida del reservorio. Los compuestos separados
pueden ser visualizados por diversos métodos. Los componentes de una mezcla pueden ser
separados por TLC debido a que éstos pueden tener diferentes coeficientes de partición entre la fase
móvil y la fase estacionaria.

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La prácticaconsistirá en dos partes:
1) separación por cromatografía de capa fina (monodimensional y bidimensional) del extracto de
lípidos de membrana de eritrocitos preparado en la práctica anterior, y
2) tinción de las placas cromatográficas mediante vapor de yodo y tinción cobre-fosfórico

1) Separación de lípidos de membrana por cromatografía de capa fina
Material y reactivos

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Muestra
Estándares defosfolípidos
Placas de TLC (Merck, Sílica 60 sobre vidrio códigos 105721 y 105628)
Tanque de TLC
Jeringas Hamilton
Mezclas de solventes para la separación cromatográfica: Solución acetona/hexano (1:3) v/v,
solución cloroformo/metanol/acético/agua (50:25:8:2) v/v, reactivo cobre-fosfórico.
- Nitrógeno grado cromatográfico (AGA S.A., Lima, Perú)
PROCEDIMIENTO
Separación de fosfolípidos por cromatografía de capafina unidimensional
− Colocar las placas de cromatografía en una estufa a 100°C por 20 minutos.
− Dejar enfriar las placas en una cámara sellada, conteniendo un desecante activo.
− Una vez fría la placa, trazar una línea paralela a uno de los bordes a un centímetro de distancia
con un lápiz blando de punta roma.
− Sembrar las muestras (5µl, equivalente a 8-12 nmol de fósforo inorgánico) en...