Practica 2

ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO ASÉPTICO IN VITRO

Cruz Diaz Nilda L., Mara Z. López A., Eliseo Gómez L., Eddie E. Tovilla B., Bárbara Montejo L.
Laboratorio de Biotecnología de la Universidad Tecnológica de la Selva. Ocosingo Chiapas.

Introducción
El termino cultivo de tejidos es muy amplio y tiene numerosos objetivos, dependiendo de la orientación que se quiera dar al laboratorio. La técnica decultivo de tejidos in vitro es muy heterogénea mediante las cuales un explante, que no es más que la parte separada de un vegetal, por ejemplo un trozo de hoja, tejido, etc., se cultiva asépticamente en un medio de composición química definida, para luego incubarla en a condiciones ambientales controladas.
Para el establecimiento de cultivo de tejidos, se deben analizar aspectos importantestales como: el explante, la sepsia, los medios de cultivo y las condiciones ambientales de incubación.
Existen cuatro fuentes de infección: la planta (su exterior o su interior), el medio nutritivo (mala esterilización), el aire y el operador (trabajo poco preciso). La más importante de estas condiciones es la planta misma, el material vegetal debería ser bien esterilizado antes de su aislamiento invitro.
El explante: En dependencia del tipo de ex plante utilizado los microorganismos superficiales o endofíticos de las plantas pueden ser introducidos al cultivo in vitro. Con el cultivo de meristemos, pueden ser eliminados muchos de ellos pero en explantes de hojas, peciolos o tallos en su mayoría pueden ser introducidos.
El ambiente de los locales de trabajo es una fuente de contaminación yasea directa o indirectamente. A través de las corrientes de aire las partículas de suelo cargadas de esporas son arrastradas y penetran a los locales por los acondicionadores de aire; son transportadas o introducidas por el hombre y permanecen en el ambiente por condiciones higiénicas inadecuadas. El uso de aires acondicionados domésticos, los cuales intercambian constantemente aire con elambiente, elevan las probabilidades de entrada de microorganismos.
El hombre interviene directamente en todas las operaciones y es una fuente primaria de contaminantes a través del estornudo, la tos, la conversación, etc.
En el trabajo dentro de la cabina del flujo laminar es donde el operario puede introducir la mayoría de los microorganismos. Incumplimientos de la disciplina tecnológica contribuyenal incremento de la contaminación.
Los equipos y el instrumental: La esterilización por calor húmedo en autoclave se emplea comúnmente para eliminar los microorganismos de los medios de cultivo, de la calidad de este paso depende en gran medida la continuidad del proceso. Los problemas en la esterilización pueden deberse a fallos en los funcionamiento de las autoclaves o a errores en sumanipulación.
Además, los instrumentos utilizados se esterilizan con calor seco o se flamean en alcohol, pero si esto no se hace por el tiempo suficiente las esporas de Bacilos spp. Pueden sobrevivir y contaminar los cultivos.
En la práctica se pretende seguir el protocolo de desinfección del explante y evaluar la técnica para la desinfestación de los tejidos a través del efecto del hipoclorito de calcioy de sodio a diferentes dosis.

Metodología
1.- el procedimiento se inició lavando el material vegetativo a utilizar con agua corriente y detergente para eliminar residuos de polvo.
2.- Luego se sumergió el material vegetativo en una solución de fungicida y/o bactericida (captan o agrimicin) por un periodo de 10-15 min agitándolo constantemente.
3.- se enjuagaron los tejidos con agua estéril yse transfirieron a una solución de alcohol al 70% por 1 o 2 min.
4.- Se transfirió los tejidos a una solución desinfectante (hipoclorito de sodio al 10% v/v o hipoclorito de calcio al 10% p/v) conteniendo de 3 a 4 gotas de tween por 10 min.
5.- Se enjuago con agua estéril los tejidos, durante 3 veces para la previa eliminación de la solución desinfectante bajo la campana laminar.
6.-...