practica 3

PRÁCTICA 3: DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS (Km Y Vmax) DE LA ENCIMA β-GLUCOSIDASA.
Objetivo: Medir la cantidad de producto liberado por tiempo.
Reactivos: Tampón tris-maleico a pH 5.4,p-nitrofenil- β-D-glucopiranósido 1,2,5,8 y 10 mM (pNPG), THAM 0.1 M a pH 12, THAM a Ph 10, y una solución de p-nitrofenol (pNP) de 1000 ppm.
Procedimiento: Cogemos los botes de incubación,considerando que para cada concentración de sustrato preparamos dos muestras y un blanco, y los rotulamos. Seguidamente realizamos el análisis enzimático. Para ello mezclamos 1ml de solución de encima con3ml de tampón tris-maleico pH 5.4 en todos los botes y cerramos los botes blancos, es decir los marcados con una b. Después añadimos 1 ml de sustrato de concentración adecuada a las muestras, y ahorasi, tapamos todos los botes de las muestras. Agitamos los botes de muestras y los metemos a incubar a 50 grados durante 30 min. Una vez transcurrido el tiempo de incubación añadimos en todos los botes8ml de THAM a pH 12 para detener la reacción. A continuación añadimos 1 ml de sustrato a los blancos a la concentración correstpondiente. Por último medimos la absorbancia en un espectofotómetro a 410nm y anotamos los resultados.
Mientras transcurren los 30 min de incubación de las muestras, preparamos las soluciones de pNP en aguan destilada a partir de una dilución de concentración 1000 ppmnecesarias para la curva patrón de calibrado. Para ello diluimos 5 ml de la solución anterior y lo diluimos a 10ml conagua destilada, y ya tenemos la solución A. A continuación preparamos las siguientesdiluciones y las enrasamos en los matraces a 25 ml con agua destilada.
Tabla con las disoluciones de la curva de calibrado:
µg pNP ml-1
0,0 ml de sol. A + 5 ml de THAM pH 10 0
0,5 ml de sol. A+ 5 ml de THAM pH 10 1
1,0 ml de sol. A + 5 ml de THAM pH 10 2
1,5 ml de sol. A + 5 ml de THAM pH 10 3
2,0 ml de sol. A + 5 ml de THAM pH 10 4
2,5 ml de sol. A + 5 ml de THAM pH 10...