Practica 4
Páginas: 8 (1806 palabras)
Publicado: 24 de abril de 2015
Alumno: Sofía Garachana Arauzo
Asignatura: Bioquímica, Grado en CyTA.
Práctica 4:
Determinación de los parámetros cinéticos (Km y Vmax) de la enzima -glucosidasa.
Introducción
Para medir la cantidad de enzima que está presente en una disolución, se mide generalmente midiendo su actividad catalítica, ya que no es posible cuantificar la cantidad de enzima en términos de concentración porquese desconoce su peso molecular o porque se trata de disoluciones heterogéneas.
Para poder hallar esa actividad catalítica es necesario conocer:
Acción global de la enzima estudiada
Procedimiento analítico para detectar el sustrato (S) o el producto (P)
Si la enzima necesita cofactores
El pH óptimo y la temperatura adecuada para su actuación
La actividad que posee una enzima se expresa en unidadesde actividad (U), que es: la cantidad de sustrato que se transforma por unidad de tiempo, o bien, la cantidad de producto formado por unidad de tiempo. La actividad específica es el número de unidades de actividad por cada mg de proteína.
Para calcular Km y Vmax se necesita conocer la velocidad de reacción a las diferentes concentraciones de sustrato, para así poder realizar sus inversos y poderelaborar el gráfico de dobles recíprocos, teniendo en cuenta la ecuación de Lineweaver-Burk:
Objetivos
El objetivo de esta práctica es determinar los parámetros cinéticos Km y Vmax para la enzima β-glucosidasa. Para lograr este objetivo es necesario que antes llevemos a cabo los siguientes objetivos específicos:
Evaluación experimental de la actividad de una enzima a diferentesconcentraciones de sustrato.
Conocer las diferentes representaciones lineales de la ecuación de Michaelis-Menten.
Calcular Km y Vmax.
Cinética enzimática
El ensayo de esta práctica se basa en la determinación colorimétrica (espetofotometría) del para-nitrofenol (pNP: amarillo) que se libera por la acción catatalítica de la β-glucosidasa (βDG) sobre un sustrato artificial, elp-nitrofenol-β-D-glucopiranósido (pNPG).
La reacción catalizada corresponde a:
Reactivos:
R.1 Tampón tris-maleico a pH 5,4: Se disolvían 24,23 g de THAM (trishidroximetilaminometano) y 23,21 g de ácido maleico en 1 l de agua destilada (sol. 1). Se preparaba una solución de NaOH 0,2 N (sol. 2). Para ajustar el pH de la solución tampón a pH 5,4 se mezclaban 250 ml de sol. 1 con 50 ml de sol. 2 y se diluían con agua hasta 1 l.
R.2p-nitrofenil--D-glucopiranósido 1, 2, 5, 8 y 10 mM (pNPG): Se diluía la cantidad necesaria de sustrato en un volumen adecuado de tampón tris-maleico pH 5,4.
R.3 THAM 0,1 M a pH 12: se disuelven 12,144 g de THAM en 800 ml de agua ajustando el pH a 12 con NaOH 0,5 M y llevando el volumen a 1 l
R.4 THAM a pH 10: se disuelven 12,144 g de THAM en 800 ml de agua y se enrasa a 1 l.
R.5. Solución dep-nitrofenol (pNP) de 1000 ppm
Protocolo experimental:
Para llevar a cabo la práctica es necesario rotular inicialmente los botes de incubación. Para ello hemos de considerar que para cada concentración de sustrato se preparan dos muestras (se incuban el enzima y el sustrato juntos) y un blanco (el sustrato es adicionado después de la incubación). Así, para cada concentración de sustrato rotularemoslos botes según se indica en el siguiente ejemplo:
Donde 2, hace referencia a la concentración de pNPG y los subíndices 1 y 2 indican las muestras por duplicado y b el blanco.
El análisis enzimático implica los siguientes pasos:
El procedimiento supone mezclar 0,1 ml de solución de enzima con 3,9 ml de tampón tris-maleico pH 5,4.
A continuación cerramos todos los botes que sean blancos (esdecir aquellos cuyo subíndice sea “b”).
El siguiente paso es adicionar un 1 ml de sustrato de la concentración adecuada (pNPG) a las muestras.
Se tapán los botes de las muestras
Todos los botes se agitan ligeramente y se someten a incubación a 50ºC durante 20 min.
Transcurrido este tiempo se adicionan en todos los botes 8 ml de THAM a pH 12 para extraer el pNP liberado y para detener la reacción....
Asignatura: Bioquímica, Grado en CyTA.
Práctica 4:
Determinación de los parámetros cinéticos (Km y Vmax) de la enzima -glucosidasa.
Introducción
Para medir la cantidad de enzima que está presente en una disolución, se mide generalmente midiendo su actividad catalítica, ya que no es posible cuantificar la cantidad de enzima en términos de concentración porquese desconoce su peso molecular o porque se trata de disoluciones heterogéneas.
Para poder hallar esa actividad catalítica es necesario conocer:
Acción global de la enzima estudiada
Procedimiento analítico para detectar el sustrato (S) o el producto (P)
Si la enzima necesita cofactores
El pH óptimo y la temperatura adecuada para su actuación
La actividad que posee una enzima se expresa en unidadesde actividad (U), que es: la cantidad de sustrato que se transforma por unidad de tiempo, o bien, la cantidad de producto formado por unidad de tiempo. La actividad específica es el número de unidades de actividad por cada mg de proteína.
Para calcular Km y Vmax se necesita conocer la velocidad de reacción a las diferentes concentraciones de sustrato, para así poder realizar sus inversos y poderelaborar el gráfico de dobles recíprocos, teniendo en cuenta la ecuación de Lineweaver-Burk:
Objetivos
El objetivo de esta práctica es determinar los parámetros cinéticos Km y Vmax para la enzima β-glucosidasa. Para lograr este objetivo es necesario que antes llevemos a cabo los siguientes objetivos específicos:
Evaluación experimental de la actividad de una enzima a diferentesconcentraciones de sustrato.
Conocer las diferentes representaciones lineales de la ecuación de Michaelis-Menten.
Calcular Km y Vmax.
Cinética enzimática
El ensayo de esta práctica se basa en la determinación colorimétrica (espetofotometría) del para-nitrofenol (pNP: amarillo) que se libera por la acción catatalítica de la β-glucosidasa (βDG) sobre un sustrato artificial, elp-nitrofenol-β-D-glucopiranósido (pNPG).
La reacción catalizada corresponde a:
Reactivos:
R.1 Tampón tris-maleico a pH 5,4: Se disolvían 24,23 g de THAM (trishidroximetilaminometano) y 23,21 g de ácido maleico en 1 l de agua destilada (sol. 1). Se preparaba una solución de NaOH 0,2 N (sol. 2). Para ajustar el pH de la solución tampón a pH 5,4 se mezclaban 250 ml de sol. 1 con 50 ml de sol. 2 y se diluían con agua hasta 1 l.
R.2p-nitrofenil--D-glucopiranósido 1, 2, 5, 8 y 10 mM (pNPG): Se diluía la cantidad necesaria de sustrato en un volumen adecuado de tampón tris-maleico pH 5,4.
R.3 THAM 0,1 M a pH 12: se disuelven 12,144 g de THAM en 800 ml de agua ajustando el pH a 12 con NaOH 0,5 M y llevando el volumen a 1 l
R.4 THAM a pH 10: se disuelven 12,144 g de THAM en 800 ml de agua y se enrasa a 1 l.
R.5. Solución dep-nitrofenol (pNP) de 1000 ppm
Protocolo experimental:
Para llevar a cabo la práctica es necesario rotular inicialmente los botes de incubación. Para ello hemos de considerar que para cada concentración de sustrato se preparan dos muestras (se incuban el enzima y el sustrato juntos) y un blanco (el sustrato es adicionado después de la incubación). Así, para cada concentración de sustrato rotularemoslos botes según se indica en el siguiente ejemplo:
Donde 2, hace referencia a la concentración de pNPG y los subíndices 1 y 2 indican las muestras por duplicado y b el blanco.
El análisis enzimático implica los siguientes pasos:
El procedimiento supone mezclar 0,1 ml de solución de enzima con 3,9 ml de tampón tris-maleico pH 5,4.
A continuación cerramos todos los botes que sean blancos (esdecir aquellos cuyo subíndice sea “b”).
El siguiente paso es adicionar un 1 ml de sustrato de la concentración adecuada (pNPG) a las muestras.
Se tapán los botes de las muestras
Todos los botes se agitan ligeramente y se someten a incubación a 50ºC durante 20 min.
Transcurrido este tiempo se adicionan en todos los botes 8 ml de THAM a pH 12 para extraer el pNP liberado y para detener la reacción....
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