Practica 9 Biologia Molecular

Sesión No. 9
Amplificación de un fragmento del gen de -globina humana mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

OBJETIVO: Analizar el principio de la PCR y entender los principales puntos de optimización de la técnica.

FUNDAMENTO:
El abril de 1983 Kary Mullis dio a conocer la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa ó PCR. Esta técnica ha invadido de tal forma labiología molecular que hoy en día sería muy díficil imaginar esta ciencia sin ella.
La Reacción PCR es un método de amplificación de secuencias específicas de ADN. Este método se fundamenta en el uso de una ADN polimerasa termoestable para extender dos oligonucleótidos iniciadores sobre el templado a fin de sintetizar un amplicón.
Mediante una serie de ciclos de replicación se pueden producirmillones de amplicones en un par de horas. En una reacción de PCR estándar se incluye: el ADN problema, iniciadores (dos oligonucleótidos: sentido y antisentido, de 20-30 pb), desoxiribonucleótidos trifosfato (dNTP’s, N= A, G, C ó T), ADN polimerasa termoestable (p. ej. Taq ADN polimerasa), cloruro de magnesio (MgCl2) y buffer de reacción.

El ciclado de las temperaturas se lleva a cabo en uninstrumento llamado termociclador, en el cual los cambios de temperatura respecto al tiempo son finamente controlados. En la mayoría de los casos, cada ciclo de PCR contiene una secuencia de 3 niveles de temperatura: (i) 94/95°C para separar la cadena doble del ADN (desnaturalización); (ii) temperatura apropiada para la unión de los iniciadores (alineamiento); y (iii) temperatura apropiada para laelongación de la cadena de ADN (extensión).
Después de la PCR, el producto que consiste en millones de copias del amplicón, es analizado por electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. Éste análisis permite estimar el tamaño molecular de los productos, que deben corresponder al tamaño específico predeterminado por los sitios de unión de los iniciadores.
La técnica de PCR es extremadamenteversátil por lo que actualmente se aplica en diversos campos.

MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS

PARA PARTE I:
Muestras de ADN genómico
oligo sentido β-globina 10 M
oligo antisentido -globina 10 M
Agua libre de nucleasas
Enzima Taq polimerasa 5 U/l
Buffer 10X para la enzima
MgCl2 50 mM
dNTPs 10 mM
Hielo

Puntas desechables para p10 y p100
Gradillas para tubos de 1.5 ml y para tubosde 0.2 ml
Tubos de 0.6 y 0.2 ml
Juegos de micropipetas
Microfuga
Vortex
Termociclador

PARA PARTE II:
Marcador de peso molecular
Bromuro de etidio
TAE 50X
Buffer de carga 6X
Agarosa
Cámaras de electroforesis
Termociclador
Transiluminador
Peines
Fuente de poder

PROCEDIMIENTO

PARTE I:
Reacción de PCR

* Antes de empezar da un pulso corto en la microfuga a todos losreactivos que se entregaron y a tu muestra de gDNA.

* Marca tus tubos de PCR de tal manera que los puedas identificar fácilmente.

* Preparar la mezcla de reacción añadiendo los reactivos en el siguiente orden (mantener en hielo):

Reactivos | Volumen |
| gDNA sin diluir | gDNA diluido | control (-) |
Agua estéril | 18.3 l | 18.3 l | 18.3 l |
Buffer 10X | 2.5 l | 2.5 l | 2.5 l |MgCl2 50 mM | 0.75 l | 0.75 l | 0.75 l |
dNTP´s 10 mM | 0.25 l | 0.25 l | 0.25 l |
oligo sentido 10 µM | 1.0 l | 1.0 l | 1.0 l |
oligo antisentido 10 µM | 1.0 l | 1.0 l | 1.0 l |
ADNg | 1.0 l | 1.0 l | 1.0 l de agua |
Taq Polimerasa 1U/l | 0.2 l | 0.2 l | 0.2 l |
* Con tu ADNg haz una dilución 1:10 y de ahí toma 1 l para tu reacción de PCR.

* Programar el termocicladorcon el siguiente protocolo de amplificación:

Etapa | Temperatura | Tiempo | No. Ciclos |
Desnaturalización inicial | 94 °C | 4 min. | 1 |
Desnaturalización | 94 °C | 45 s | 40 |
Alineamiento | 57 °C | 45 s | |
Extensión | 72 °C | 60 s | |
Extensión final | 72 °C | 5 min. | 1 |

PARTE II:
Análisis electroforético del producto de PCR

1. Preparar un agarosa al 1.5%...