Practica 9 De Laboratorio

8BIOQUIMICAManual de Laboratorio de Bioquímica I PRACTICA NO. 9 ENZIMAS: TIROSINASA INTRODUCCIÓN
Enzimas son proteínas que catalizan reacciones químicas (termodinámicamente posibles). En estas reacciones, los sustratos son convertidos en productos. La clave del funcionamiento de las enzimas es que disminuyen la energía de activación de la reacción (catalizadores). Las enzimas son muy específicastanto por el tipo de reacción como por el sustrato. La actividad puede ser afectada por: • Inhibidores • Activadoras • Temperatura • pH • Concentración del sustrato etc. La cantidad de la enzima puede ser expresada en moles o en unidades de actividad enzimática. Para la determinación de la actividad generalmente se utilizan espectrofotometría. La actividad enzimática expresa la cantidad desustrato convertido por unidad de tiempo, en un volumen determinado (puede calcular por contenido de proteínas o por peso de la muestra en este volumen). Para la determinación de la cantidad del sustrato convertido se utiliza la Ley de BeerLambert. Existe dos unidades para la actividad enzimático en el Sistema Internacional de Unidades: katal (kat) = mol sustrato convertido / s, Unidad de actividadenzimático (U) = µmol sustrato convertido /min. La actividad específica (U/mg proteína) también se encuentra mucho en publicaciones científicas. La tirosinasa es una enzima que cataliza la oxidación de fenoles y está presente en las plantas y animales. Es una enzima cuprífera, lo que significa que contiene cobre como cofactor. La tirosinasa es responsable del pardeamiento enzimático. Se descubrió porprimera vez en los champiñones, dónde el efecto de pardeamiento tras un daño mecánico es más evidente. En el campo de los alimentos, el pardeamiento enzimático puede ser un problema muy serio en frutas, champiñones, patatas y otros vegetales, y también en algunos crustáceos, e incluso en la industria del vino, al producir alteraciones en el color que reducen el valor comercial de los productos, oincluso los hacen inaceptables para el consumidor. La enzima se encuentra en el interior del tejido vegetal y dado que la reacción requiere O2, no ocurre hasta que el interior queda expuesto al exterior.

Manual de Laboratorio de Bioquímica I
La determinación de la actividad enzimática se hace por espectrofotometría, midiendo la velocidad de conversión del DOPA a DOPAcromo a 420nm.OBJETIVOS:
• • • • Practicar el uso del espectrofotómetro y sus aplicaciones en el laboratorio Aprender los principios de la extracción de las enzimas de tejidos vegetales Introducir al estudiante en la determinación de la actividad enzimática Observar el efecto de la concentración de enzima con respecto a su actividad.

REACTIVOS • • • •
Solución buffer Fosfato de sodio, 0.1M pH 7.2 Solución bufferFosfato de sodio, 0.1M pH 6.0 DL-DOPA 20Mm (en el buffer fosfato de sodio pH 6.0) Para la extracción de la enzima traer bananos, papas, hongos o manzanas. Libre elección.

EQUIPO
• • • Espectrofotómetro Centrífuga refrigerada Balanzas

MATERIALES Y CRISTALERIA • • • • • • • • • •
Gasa Espátula Probetas 10ml Beakers 50ml Tubos para centrifuga 20-25ml Hielo Tubos de ensayo Cubeta para elespectrofotómetro Lápiz Papel milimetrado

PROCEDIMIENTO A. Extracción de la enzima 1. Pese 20g del material elegido. Colóquelo en un mortero enfriado previamente y agregue 10ml buffer de Fosfato de sodio, 0.1M pH 7.2. Muela hasta hacer una pasta.

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2. Filtre a través de 2 capas de gasa y centrifugue durante 5 minutos a 3500rpm a 4°C. 3. Decante elsobrenadante (extracto de la enzima) en un tubo de ensayo y ciérrelo con parafilm, manteniéndolo frío (en hielo) mientras lo usa.
4. Haga una dilución del extracto así: Si usó hongos ó papas, dilúyalo con 9 volúmenes de buffer de Fosfato de sodio, 0.1M pH 7.2 (1:10) Si usó bananos, diluya con 4 volúmenes (1:5) Si usó manzana, úselo sin diluir.

B. Ensayo Enzimático
1. Como blanco utilice la mezcla de...