practica biomol

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PRÁCTICA 1

SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFIA EN PAPEL

INTRODUCCIÓN
La cromatografía es una técnica que se utiliza ordinariamente para separar una serie de
solutos disueltos en un disolvente común, utilizando uno o más de los siguientes fenómenos:
adsorción diferencial, partición líquido-líquido o intercambio iónico. Las variantes más comunes
empleadas para este fin, sonla cromatografía en columna, cromatografía en papel y
cromatografía por intercambio iónico.

La cromatografía en papel es una técnica muy sencilla basada en la adsorción diferencial
y la partición líquido-líquido, este último fenómeno se refiere al hecho que una sustancia (soluto)
puede exhibir diferentes grados de solubilidad en 2 o más disolvente. Usualmente, en una pieza
de papel filtro seaplican puntos (gotas) de una solución acuosa con la mezcla de compuestos,
cerca del borde de uno de los dos márgenes libres; se engrapan los bordes libres para formar un
cilindro y se coloca en una cámara saturada con el vapor de un segundo disolvente (orgánico).
El fondo de la cámara contiene una cantidad de disolvente el cual migra a través del papel por
capilaridad, se cierra la cámara yse deja que la cromatografía proceda hasta que el disolvente
alcanza el tope del papel. Si las muestras no son coloreadas, después de la cromatografía se
revelan haciéndolas reaccionar con un reactivo específico.

Las moléculas pueden caracterizarse midiendo la distancia de migración del disolvente y
la distancia de migración de una fracción determinada, si la relación de tales distancias seprocesa como distancia del soluto/distancia del disolvente, se conoce el valor de Rf para esa
sustancia; si las condiciones se mantienen constantes, este valor es reproducible y puede
utilizarse para caracterizar una molécula. El valor de Rf variará de acuerdo al disolvente o
mezcla de disolventes, la temperatura y la naturaleza del papel que sean utilizados. Esta técnica
puede practicarsehaciendo que el disolvente ascienda o descienda a través del papel
denominándose respectivamente, cromatografía ascendente o descendente.

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OBJETIVOS

- Comparar las propiedades de solubilidad de los diferentes aminoácidos mediante su separación
por cromatografía en papel.
- Separar e identificar los aminoácidos presentes en un extracto hidrolizado de células vegetales,
por medio de lacromatografía en papel.

Material

Reactivos

1 mortero con pistilo.
1 balanza semianalítica.
1 centrífuga clínica.
5 tubos de vidrio de 15 x 100 mm.
2 tubos para centrífuga.
1 piseta con agua destilada.
1 gradilla.
1 cámara cromatográfica.
1 atomizador.
1 horno o parrilla eléctrica.
1 microjeringa de 25 o 50 l.
1 hoja de papel Whatman No. 1 (23 x 28cm).

Mezcla deButanol-Ac.acético-agua 4:1:1 v/v.
Soluciones al 0.1% de cada uno de los 20
aminoácidos.
Solución de ninhidrina 0.1 % en etanol- piridinaacetona (7:2:1) v/v.
Mezcla de metanol-cloroformo-agua (12:5:3) v/v.
Cloroformo (presentación comercial).
Material que debe traer el alumno.
Muestra para extracción de aminoácidos, se sugiere
hojas de perejil (Petroselinum sativum).
1 carrete de hilo blanco.
1regla.
1 lápiz.
1 par de guantes de látex.

MÉTODO

A) Extracción de aminoácidos totales de un extracto crudo.

1. Pese 1g de tejido (hojas) y colóquelo en el mortero con 6 ml de una mezcla de metanolcloroformo-agua (MCA) en proporción 12:5:3 v/v y macere, si se evapora el solvente
agregue otros 6 ml.

2. Centrifugue el macerado a 3 000 rpm, durante 5 minutos.

3. Separe el sobrenadanteen un tubo de ensayo y agregue a la pastilla otros 3 ml de
metanol-cloroformo-agua (MCA) 12:5:3 v/v, agite.

4. Centrifugue nuevamente a 3 000 rpm, durante 5 minutos.

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5. Mezcle el sobrenadante con el que obtuvo en el paso 4 y deseche la pastilla.

6. A los sobrenadantes reunidos, agrégueles 3 ml de cloroformo y 4.5 ml de agua destilada.

7. Centrifugue a 3 000 rpm, durante 5...