practica bioquimica 2

30. Caracterización cinética de la fosfatasa
alcalina
José Antonio Bárcena Ruiz, Concepción García Alfonso,
Carmen Alicia Padilla Peña, Emilia Martínez Galisteo,
Jesús Díez Dapena
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales,
Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba

RESUMEN

La fosfatasa alcalina es una enzima que cataliza la hidrólisis del enlaceéster fosfórico entre un grupo orgánico y un grupo fosforilo a pH
alcalino, lo que libera fosfato al medio. En esta práctica se van a estudiar
algunos aspectos cinéticos de la fosfatasa alcalina comercial de mucosa
intestinal bovina. Para ello se va a emplear un método de ensayo de la
actividad de esta enzima que emplea como sustrato un éster de fosfato
artificial, el p-nitrofenilfosfato, cuyahidrólisis da lugar a fosfato y a pnitrofenol. Éste último adquiere color amarillo a pH alcalino por lo que se
puede cuantificar colorimétricamente a 405 nm. Se obtendrá la curva de
progreso de la reacción catalizada y se determinará la velocidad inicial y
la concentración de enzima. Se comprobará la dependencia de la
velocidad de reacción con la concentración de enzima y se calcularágráficamente la Km de la enzima.
Palabras clave: Eaddie Hofstee, Lineweaver-Burk, Unidades Internacionales
de actividad enzimática, velocidad máxima.
Abreviaturas empleadas. PNPP: p-nitrofenilfosfato; PNP: p-nitrofenol; UI:
Unidades Internacionales de actividad enzimática.

1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
1.1. Cinética enzimática
La cinética enzimática es la parte de la Enzimología que se ocupa delestudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas y las
causas de su variación. Los ensayos enzimáticos se emplean rutinariamente
en muchos laboratorios clínicos para el diagnóstico de numerosas
enfermedades, bien observando velocidades de reacción anormales o bien
observando niveles enzimáticos inadecuados en el plasma u otros tejidos.
Un ensayo enzimático se basa en laactuación de la enzima sobre una
sustancia, llamada sustrato, catalizando su conversión en otra específica,
conocida como producto. Normalmente algún elemento de los que intervienen
en la reacción absorbe luz a una longitud de onda determinada, con lo que la
reacción puede seguirse por colorimetría o espectrofotometría.
1

1.2. Fosfatasa alcalina
La fosfatasa alcalina (Ortofosfórico monoésterfosfohidrolasa, (EC 3.1.3.1)
es una enzima ampliamente distribuida que hidroliza (3) el enlace éster (1)
fosfórico entre un grupo fosfato y un radical orgánico a pH básico (pH óptimo
entre 9 y 10) liberando fosfato inorgánico. Está presente en riñón, hígado,
intestino y hueso. La medida de niveles anormales de fosfatasa alcalina en el
suero indican la existencia de enfermedades óseasdegenerativas (raquitismo,
osteomalacia, hiperparatiroidismo secundario, osteosarcoma) o bien daños
hepáticos. El aumento fisiológico de los niveles plasmáticos de fosfatasa
alcalina se produce en animales en fase de crecimiento (se está formando
tejido óseo) o en hembras gestantes (fosfatasa alcalina de la placenta).
Esta enzima, también se utiliza como
control de la adecuada
pasterización de la lechey crema, dado que la fosfatasa alcalina se inactiva
por calentamiento.
1.3. Ensayo enzimático
Como sustrato de la fosfatasa alcalina utilizaremos un compuesto
artificial: p-Nitrofenil-fosfato que, al poseer un resto orgánico con un grupo
fosfato unido, puede ser reconocido por la enzima.
El sustrato al ser hidrolizado origina un producto, el p-Nitrofenol,
compuesto coloreado que ensolución alcalina absorbe a una longitud de
onda de 405 nm, por lo que su aparición en el transcurso de la reacción
(Figura 1) puede seguirse colorimétricamente.
Para detener la reacción se añadirá fosfato, ya que el exceso de este
producto de la reacción inhibe la actividad enzimática.

O

HO P OH

Fosfatasa
alcalina

O

+

O
O

H2 O

+ HO P OH

O

+

N

N

-

H...