Practica Bioquimica

UNIDAD DIDÁCTICA 2: METABOLISMO


[pic]










SEMINARIO 5: CARACTERIZACIÓN CINÉTICA DE LA FOSFATASA ALCALINA

Prof.: Dra. Pilar Hernández Sanchez
SEMINARIO 5: CARACTERIZACIÓN CINÉTICA DE LA FOSFATASA ALCALINA.


OBJETIVO:
Demostrar mediante la realización de una reacción enzimática clásica, el efecto que tiene la concentración de sustrato sobre lavelocidad de la reacción. Además, comprobar que la reacción enzimática a realizar concuerda con los postulados de Michaelis y Menten. Para ello, el estudiante deberá comprender y determinar valores de Km y Vmax.
FUNDAMENTO:
La cinética enzimática es la parte de la enzimología que se ocupa del estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas y las causas de su variación. Losensayos enzimáticos se emplean rutinariamente en muchos laboratorios clínicos para el diagnóstico de numerosas enfermedades, bien observando velocidades de reacción anormales o bien observando niveles enzimáticos inadecuados en el plasma u otros tejidos.
Un ensayo enzimático se basa en la actuación de la enzima sobre una sustancia, llamada sustrato, catalizando su conversión en otra específica,conocida como producto. Normalmente algún elemento de los que intervienen en la reacción absorbe luz a una longitud de onda determinada, con lo que la reacción puede seguirse por colorimetría o espectrofotometría.
Las enzimas son moléculas orgánicas capaces de catalizar reacciones bioquímicas mediante la disminución de la energía de activación que se requiere para que la reacción se lleve acabo. Sin las enzimas, los procesos metabólicos que se llevan a cabo dentro de las células tardarían mucho tiempo y, por lo tanto, los períodos de respuesta de adaptación al medio extracelular serían muy largos y tal vez, incompatibles con la vida.
Muchas enzimas obedecen la teoría de la cinética enzimática propuesta en 1913 por Leonor Michaelis y Maud Menten. En ella se establece que duranteuna reacción catalizada por una enzima, ésta reacciona reversiblemente con el sustrato para formar un complejo enzima-sustrato. Posteriormente, este complejo participa en una reacción como reactante para dar origen a un producto y a la enzima libre y activa, lista para participar en una nueva reacción.






Uno de los factores más importantes que afecta a la velocidad de una reacciónenzimática es, precisamente, la concentración de sustrato. Sin embargo, estudiar este efecto en el laboratorio es complicado dado que la concentración de sustrato varía durante el curso de la reacción. Un método que simplifica la realización de experimentos de cinética es medir la velocidad inicial o V0 donde la concentración de sustrato es mucho mayor que la concentración de la enzima. Bajo estascondiciones, cambios en la concentración de sustrato son ínfimos y por lo tanto, se considera que la concentración de sustrato se mantiene constante. Cuando la concentración de enzima se mantiene constante, el efecto que tiene una concentración variable de sustrato sobre V0 se ilustra en la ecuación de Michaelis Menten:
[pic]
A concentraciones relativamente bajas de sustrato, la velocidad dereacción aumenta en forma proporcional a la concentración de sustrato, obteniéndose una relación de tipo lineal. Sin embargo, a concentraciones más altas de sustrato, la velocidad no aumenta considerablemente. Es entonces cuando la velocidad de reacción alcanza un valor máximo Vmax, en el cual aunque se aumente la concentración de sustrato, la velocidad de reacción no varía. Por otro lado, la KMes la concentración de sustrato a la cual se alcanza la mitad de la velocidad máxima.
Esta ecuación corresponde a una hipérbola rectangular y da cuenta de la relación entre concentración de sustrato y velocidad de reacción. Pequeños cambios en la concentración de sustrato alrededor de KM producen variaciones considerables de la velocidad de reacción. Esta propiedad tiene interés regulador ya...