Practica cuantificación de proteinas

Cuantificación de Proteínas

Rossana Hernández Dueñas1, Jocabet Ricarda Hernández Sanchez1, Yadira Alejandra Martínez Marin1, Uriel Vázquez Ortiz1, Gabriel Vigueras Ramirez2,*

1Licenciatura en Ingeniería Biológica, División de Ciencias Naturales e Ingeniería Universidad Autónoma Metropolitana-Cuajimalpa, Artificios No. 40, 5° Piso Col. Hidalgo
Álvaro Obregón, C. P. 01120 México, D. F.2Departamento de Procesos y Tecnología, División de Ciencias Naturales e Ingeniería Universidad Autónoma Metropolitana-Cuajimalpa, Artificios No. 40, 6° Piso Col. Hidalgo
Álvaro Obregón, C. P. 01120 México, D. F.
*jvigueras@correo.cua.uam.mx

Palabras clave: espectroscópicas, absorbencia, proteínas, Azul de Coomassie, sencillez.

Introducción
Se sabe que la mayoría de las proteínas puedenfijar colorantes en su superficie.
La fijación del colorante va acompañada muchas veces por un cambio en las propiedades espectroscópicas del mismo (variación en el máximo de absorción).
El método de Bradford se fundamenta en la fijación del colorante Azul de Coomassie (tinte Coomassie G-250 azul) a las proteínas, dando lugar a un cambio en el color que puede ser medido en unespectrofotómetro. El método es extremadamente sensible, detectando cantidades de 1uz o incluso inferiores. Su principal inconveniente radica en que el colorante no se fija por igual a todas las proteínas, con lo cual sus resultados no son homogéneos. No obstante, su sencillez y su sensibilidad han hecho de este método uno de los más utilizados en el laboratorio.
Los estudios detallados indican que el tinte librepuede existir en cuatro diversas formas iónicas para las cuales los valores del pKa sean 1.15, 1.82, y 12.4. De las tres formas cargadas del tinte que predominan en la solución ácida el reactivo del análisis, las formas rojas y verdes más catiónicas, teniendo máximos de la absorbencia en 470 nanómetros y 650 nanómetros, respectivamente. En cambio, la forma azul más aniónica del tinte, que ata a laproteína, tiene un máximo de la absorbencia en 590 nanómetros.
Así, la cantidad de proteína puede ser estimada determinando la cantidad de tinte en la forma iónica azul. Midiendo la absorbencia de la solución en 595 nanómetro.
Como se mencionó anteriormente la especificidad en la fijación del tinte en las proteínas puede llevar a una variación considerable en la respuesta del análisis dediversas proteínas, siendo esta la desventaja principal del método. Varias modificaciones al método se han desarrollado para superar este problema.
Sin embargo, estos cambios dan lugar generalmente a un análisis menos robusto que sea a menudo más susceptible a interferencia por otros productos químicos. Por lo tanto, el método original ideado por Bradford sigue siendo la formulación más conveniente ymás ampliamente utilizada. Dos tipos de análisis se describen aquí: el análisis estándar, que es conveniente para medir entre el µg 10 y 100 de la proteína, y el microanálisis, que detecta entre el µg 1 y 10 de la proteína. Este último, aunque sea más sensible, es también interferencia más propensa de otros compuestos debido a la mayor cantidad de reactivo en relación con del tinte de la muestraen esta forma del análisis.
Resumiendo el método de Bradford, cuantifica la unión de un colorante a una proteína desconocida y la compara contra las diferentes cantidades de una proteína estándar, usualmente albúmina de suero bovino (BSA). El complejo colorante-proteína presenta un máximo de absorción a 595 nm. El colorante, en disolución acida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Estádiseñado para cuantificar entre 1 y 10 µg de proteína. Es un método simple, confiable, rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinación.
Objetivos
• Determinar la concentración de proteína de muestras de leche.
• Conocer y aplicar el método de Bradford para la cuantificación de proteína.
• Aprender el uso, manejo y cuidados del espectrofotómetro UV-Vis.
• Elaborar una curva...