Practica De Biologia Sobre Respiracion Celular

Prueba de ELISA indirecta para la detección de IgA séricaen ratones BALB/c producto de la infección cutánea causada por Leishmania mexicana.


1Laboratorio de Inmunofisiología, Facultad de Ciencias, Universidad de los Andes, Mérida-Venezuela.
Resumen

Introducción
Los parásitos del genero Leishmania pertenecen a la familia Trypanosomatidae y son los causantes de varias enfermedadesdenominadas Leishmaniasis (Quiñones et al. 2007). Muchas especies de Leishmania producen úlceras cutáneas y nódulos, otras especies dañan los órganos internos y causan leishmaniasis visceral. La técnica ELISA consiste en un ensayo inmunoenzimático usando anticuerpos como reactivo, este tipo de ensayo hace uso de enzimas acopladas a uno de los reactivos (antígeno o anticuerpo) en una prueba que permitela cuantificación a través del desarrollo de color luego de agregar un sustrato o cromógeno adecuado (Crowther J. 2001), esta técnica es muy útil para diagnostico de enfermedades ya que es posible detectar anticuerpos presentes en el suero contra antígenos de una determinada enfermedad.
Existen múltiples variantes de ELISA que permiten la detección cualitativa o la medición cuantitativa de unantígeno o anticuerpo. Las variantes mas comunes son ELISA directo en la cual el anticuerpo primario es acoplado a una enzima, ELISA indirecto en el que se utiliza un anticuerpo secundario acoplado a una enzima el cual reconoce específicamente la región Fc del anticuerpo primarioy ELISA sándwich utilizado para detectar antígenos solubles en una muestra, el cual es capturado por el anticuerpo acopladoa la fase sólida y otro anticuerpo marcado con una enzima que se une directamente a un epítope diferente. Para ELISA se utilizan varias enzimas, como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante y β-galactosidasa (Kindt J. et al. 2007).
La isotretinoína (ácido 13-cis-retinoico) es un análogo sintético de la vitamina A usado en varias enfermedades dermatológicas incluidas las formas de acné yvarias foliculitis, su función es principalmente suprimir la actividad de las glándulas sebáceas , aunque además posee un efecto dérmico antiinflamatorio a nivel local (Neofytos P.et al. 2009). En este trabajo analizamos el efecto de la isotretinoínasobre los títulos de IgA sérica en ratones BALB/c infectados con Leishmania mexicana, una de las especies causantes de leishmaniasis cutánea.Materiales y Métodos
SUEROS EMPLEADOS
Suerode ratón BALB/c sano, suero de ratón BALB/c infectado con Leishmania mexicana, suero de ratón BALB/c tratados con el agonista selectivo sintético ácido 13-cis-retinoico (Isotretinoina) durante 15 días, suero de ratón BALB/c infectado con Leishmania mexicana y tratados conjuntamente durante los primeros 15 días de infección con el agonista selectivo sintéticoácido 13-cis-retinoico (Isotretinoina), suero de ratón BALB/c infectado con Leishmaniamexicana y tratados conjuntamente durante los primeros 30 días de infección con el agonista selectivo sintético ácido 13-cis-retinoico (Isotretinoina), suero de ratón BALB/c tratados con el agonista selectivo sintético ácido 13-cis-retinoico (Isotretinoina) durante 15 días e infectados con Leishmaniamexicana eldía siguiente a la finalización del tratamiento, suero control negativo de ratón BALB/c sano, y suero control positivo de ratón BALB/c infectado con Leishmania mexicana.

PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO
Lisis celular y preparación del antígeno
El cultivo de Leishmaniamexicanaen fase estacionaria temprana fue centrifugados a 2500 rpm por 30 minutos a 4oC, el sedimento se resuspendió entampónfosfato salino (PBS) y se centrifugó comoen el paso anterior por tres veces durante 10 minutos; el sedimento final seresuspendió en amortiguador de lisis Ay posteriormente centrifugado a 2500 r.p.m. a 4 °C durante 15 minutos, se resuspendió en amortiguador de lisis B , y luego serealizó la lisis celular con cinco rondas de sonicación, la solución resultante se centrifugo a 1000 rpm por 10...