practica de determinación de la actividad de la polifenol-oxidasa (PPO) de banana

PRACTICAS DE
BIOQUÍMICA




INTRODUCCIÓN

En estas prácticas vamos a utilizar distintos métodos para determinar la actividad y las
características de una enzima que extraeremos de la banana. Esta enzima es la
polifenol-oxidasa (PPO) enzima específica de plantas que cataliza la reacción
dependiente de oxígeno en la que se transforman o-difenoles como la dopamina a oquinonas. En nuestrocaso primero de dopamina a dopamina-o-quinona y
posteriormente a 2,3-dihidroindol-5,6-quinona.

Dopamina

Dopamina-o-quinona

2,3-dihidroindol-5,6-quinona

El primer paso a llevar a cabo en el estudio de esta enzima es la purificación parcial de
la misma; que como hemos dicho será sacado de la banana, en la que buscamos
eliminar otras enzimas y sustancias presentes en nuestro sustratobase. Esta
purificación será llevada a cabo mediante varias centrifugaciones y un proceso de
cromatografía por intercambio iónico. En este último aislaremos definitivamente
nuestra proteína del resto gracias a su carga iónica que hará que nuestra proteína
quede unida a la columna, de donde más tarde la haremos eludir recogiéndola en
varios tubos. Una vez hecho el aislamiento durante lossiguientes días estudiaremos la
absorbancia en cada tubo obtenido, determinando a partir de ésta la actividad de la
proteína y su concentración en cada uno. Por último llevaremos a cabo un proceso de
electroforesis en el que estudiaremos la enzima en su estado desnaturalizado; donde
la migración será proporcional a la carga y al tamaño de la proteína pero no a su
forma, y en su estado nativo; enel que migra según las tres características.

MATERIAL Y MÉTODOS:

Día 1 : Extracción y purificación parcial (1ºparte) de la PPO:
Tampones:
Usados a lo largo de todo el periodo de prácticas :
-Tampón fosfato potásico 20 mM pH 7: 250mL
-Tampón fosfato potásico 40mM pH8: 1L
-Tampón fosfato potásico 80mM pH8: 1L
-Tampón fosfato potásico 100mM pH7:1L
-Tampón Tris-HCl 1.5M pH8.8: 25mL-Tampón Tris-HCl 1M pH6.8: 25mL
-Tampón electroforesis 10X (Tris 0.25M, Glicina 1.92M, SDS 1%): 1L
-Solución de tinción geles (Azul brillante de coomassie R-250 0.25%, etanol 40%y acético
10%).250mL
-Solución desteñidora (etano 40% y acético 10%): 1 L
Material:
-pHchimetro
-Probeta
-Pipeta Pasteur
-Eppendorf y tubos de ensayo

Método:
El primer día de prácticas lo primero que realizamosfue la preparación de los tampones
necesarios en las prácticas a partir de los datos previamente calculados. Para ello cada grupo
elaboró un tampón concreto siendo en nuestro caso el Tris-HCL 1.5M pH 8.8 : 25mL. Para este
tampón según nuestros cálculos se necesitaban 4.54g de Tris que mezclamos en un probeta
con 20mL de agua destilada hasta homogeneizar. A continuación usamos el pHchimetro paradeterminar el pH inicial de la reacción que era 10.76, que después iríamos ajustando
añadiendo HCl hasta el valor de pH necesario: pH 8.8. El volumen de HCl añadido fue 5 mL y el
tampón al acabar tuvo un volumen total de 26mL. Una vez hecho éste fue guardado a 4ºC en la
nevera.

->Extraer PPO: (Común)
El siguiente paso de esta práctica fue preparar el extracto de plátano; en el que seencuentra
nuestra enzima, un proceso que se hizo de forma común para todos los grupos. Así, se
cogieron 20 g de extracto de plátano, y se mezclaron con 180 mL de tampón fosfato 20mM y
Tritón 1%. Este último compuesto añadido es un detergente que colabora con la disgregación
de los tejidos, mientras que el tampón constituye la disolución base. Hecho esto pasamos a
triturar la mezcla, que despuésse dejó reposar, todo ello en un ambiente frio, para conservar
la actividad de nuestra proteína.
A continuación preparamos varios Eppendorf de igual peso, y los centrifugamos a 13.000 g a
4ºC durante media hora, con la finalidad de precipitar todo aquellos restos celulares y otras
sustancias innecesarias, y aislar de forma parcial nuestra proteína que permanecerá en el
sobrenadante, también...