Practica de diagmol

INTRODUCCION




OBJETIVO:

Conocer y realizar la técnica de Western Blot para la detección de proteína mediante la reacción antigeno-anticuerpo .












METODOS
1) Elaborarlos geles

Gel Running:
1. 1.8 ml de acrilamida-bisacrilamida al 30%
2. 1.25 ml de Tris HCl 1.5M pH 8.8
3. 50 µl de SDS al 10%
4. 1.85 ml de agua destilada
5. Agitar la mezcla
6. 100 µl deperisulfato de amonio al 10%
7. 10 ml de TEMED
8. Y de la mezcla agregar 3 ml que son 2/3 del molde
Gel Staking
1. 500 µl de acrilamida-bisacrilamida al 30%
2. 370 µl de Tris HCl 1M pH 6.8
3. 30µl de SDS al 10%
4. 2.02 µl de agua bidestilada
5. Agitar la mezcla
6. 50 µl de perisulfato de amonio al 10%
7. 5 µl de TEMED
8. Tomar 1.5 ml de la mezcla y poner el peine para los pozos

2)Electroforesis

1. Armar la cámara de electroforesis
2. Colocar el gel dentro de la cámara de electroforesis.
3. Agregar en cada pozo 15 µl de proteína MI/influenza + buffer de carga (azul debromofenol, SDS, β-mercaptoetanol) en relación 3:1.
4. Agregar Buffer la tanque y sellar.
5. Correr el gel a 20mA constantes por 1 - 1.5 horas.
6. Teñir el gel sumergiéndolo en azul de commasie.
7.Dejar teñir toda la noche.

3) Transferencia “Sándwich”
1. Armar el sandwich; se compone de 2 placas, una positiva (roja) y negativa (negra). Se agregan los materiales desde la placa negativa en elsiguiente orden: esponja, papel filtro, gel de poliacrilamida, membrana de nitrocelulosa, papel filtro, esponja y placa roja.
2. Llenar la cámara de transferencia de buffer e introducir elsándwich.
3. Realizar la transferencia a 60 volts por 1 hora





4) Inmunoblotting
1. Lavar 1 vez la membrana con TBS pH 7.5
2. Adicionar solución bloqueadora (albumina bovina 1%- TBS-Tween)
3.Incubar 30 minutos en agitación
4. Preparar 5 ml de suero humano (suero policlonal). Con dilución 1:6000 en TBS-T
5. Incubar a 4°C toda la noche
6. Retirar el anticuerpo primario y lavar 3 veces...