Practica de Extracción de adn





Extracción de ADN



Laboratorio de Ingeniería Genética
M.C Carmen Daniela González Barriga
Alumno: Rosslyn Vianey Alvidrez Arras



Objetivo.

Utilizar y conocer el método de extracción de ADN Miniprep para posteriormente, cuantificar el ADN extraído del plásmido Psport2 realizando una digestión enzimática con la enzima EcoR1. Se espera obtener como resultado en el gel dosbandas de 266pb y 4,044 pb como resultado del corte de la EcoR1 (266).

Introducción.

Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosomal los cuales están presentes en algunas células bacterianas, levaduras y hongos. Los mismos poseen DNA de doble hebra, mayormente son circulares pero también se han encontrado plásmidos lineales. La replicación de los plásmidos es independiente de lareplicación del cromosoma del huésped ya que los plásmidos poseen su propio origen de replicación. El número de copias de un plásmido en la célula es variable, todo depende del origen de replicación del que posea el mismo y su regulación. Los plásmidos no son esenciales para el desarrollo o supervivencia de la célula pero le proveen una ventaja competitiva a las células que los poseen, dado a que losplásmidos poseen genes que le confieren características selectivas a su huésped tales como resistencia a antibióticos, nuevas habilidades metabólicas como degradación de carbohidratos, factores de virulencia y producción de toxinas entre otros.
Los plásmidos poseen un interés singular en Ingeniería Genética por ser uno de los sistemas vectores más sencillos de usar. Un vector de clonación es unsistema que permite introducir en una célula hospedadora un fragmento de DNA que se pretende clonar; en esta célula hospedadora el vector se replica y expresa, en su caso. La molécula que resulta de la unión de un DNA vector con el DNA de interés (denominado entonces "inserto") se denomina molécula de vector recombinante.
Existen unos requerimientos básicos que un plásmido debe poseer para que seaun buen vector al aplicar su uso en la biología molecular. Debe poseer un origen de replicación, un gen para un marcador de selección (ya sea resistencia a algún antibiótico) y un lugar de clonaje múltiple (MCS). El MCS es una región donde pueden digerir varias enzimas de restricción pero solamente una vez. Existen diversos métodos para el aislamiento de plásmidos. Las técnicas de Minipreps o minipreparaciones de plásmidos, permiten la recuperación de plásmidos de DNA circular sobre el DNA cromosomal. El tratamiento de las células con una base de pH alto o un detergente interrumpe el apareamiento de las bases nitrogenadas, ocasionando que el DNA cromosomal se desnaturalice y se separe. Por el contrario la configuración superenrrollada del plásmido se mantiene estable.
La lisis alcalinaes el método mayormente utilizado para el aislamiento de plásmidos circulares proveniente de células bacterianas. Existen diversos protocolos para realizar lisis alcalina pero todos se rigen por los siguientes pasos básicos.
a. Remover las células del medio de cultivo en caldo mediante centrifugación.
b. Descartar el sobrenadante para reducir contaminación mediante fragmentos de la paredcelular del huésped.
c. Resuspender las células en un amortiguador que contenga Tris, EDTA y glucosa.
d. Lisar las células con NaOH y SDS.
e. Unión de las hebras de DNA y remoción de contaminación mediante el acetato de potasio.
f. Precipitación del DNA de plásmido mediante alcohol (etanol o isopropanol) y una sal (Acetato de amonio, Cloruro de litio, Cloruro de sodio o Acetato de sodio).
g.Enjuague del material genético con EtOH al 70%.
h. Resuspender el material genético.
Con este protocolo se obtiene DNA plasmídico a partir de cultivos bacterianos a pequeña escala (1.4 ml), mediante tratamiento con lisis alcalina y SDS. La obtención de DNA plasmídico a pequeña escala es esencial para el análisis de colonias recombinantes.
Principio del método: Este método explota las...