practica de la determinacion de la enzima LDH en pollo

PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA LACTATO DESHIDROGENASA DE MÚSCULO ESQUELÉTICO DE POLLO Y SU MONITOREO
Hernández Cruz, César Iván; Martínez Franco, Mónica Itzel; Martínez Sámano, Edith y Miranda Cruz, Patricia Esther
INTRODUCCIÓN
Las isoenzimas son enzimas que difieren en sus secuencias aminoacídicas, pero catalizan la misma reacción. Estas enzimas presentan diferentes parámetros cinéticos oresponden a distintas moléculas reguladoras. Están codificados por genes distintos, que normalmente aparecen por duplicación génica y posterior divergencia. A menudo, las isoenzimas pueden distinguirse una de otra por sus propiedades bioquímicas, tales como su movilidad electroforética 1. Un ejemplo de lo anterior es la lactato deshidrogenasa (LDH) que cataliza la reducción del piruvato a lactatomediante la utilización del dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADH). Esta enzima tiene una estructura cuaternaria tetramérica, resultante de la combinación de los monómero H o M, que reciben esta denominación atendiendo a su localización preferentemente en el corazón o en el músculo. LDH se encuentra distribuida en el citoplasma celular de casi todos los tejidos. Su contenido es especialmentealto en los riñones, el cerebro, el hígado, el músculo esquelético y el cardíaco, los eritrocitos y los tejidos tumorales, aunque todos ellos presentan distintas proporciones de las cinco isoenzimas existentes. En el músculo esquelético abunda la isoenzima 5 que se encuentra formada por 4 monómeros M. Las concentraciones de la LDH en los tejidos son unas veces superiores a las existentes en elplasma, por lo que incluso pequeños daños tisulares pueden provocar la liberación de la enzima y aumentar su concentración en el plasma de forma significativa.2

Las proteínas se purifican mediante procedimientos de fraccionamiento. En una serie de etapas independientes, las diversas propiedades fisicoquímicas de la proteína de interés se usan para separarla de manera progresiva de otrassustancias. La idea no es necesariamente llevar al mínimo la pérdida de la proteína deseada, sino eliminar en forma selectiva los demás componentes de la mezcla de manera que quede sólo la sustancia buscada3.

Existen varios métodos para determinar la concentración de proteínas de una muestra, tales como la determinación de la absorbancia a 280 nm, o mediante los métodos de Biuret o de Lowry. Elmétodo que se utilizará durante esta práctica se basa en un principio diferente: se emplea un colorante hidrofóbico cuyas disoluciones acuosas en presencia de ac. fosfórico tienen un color pardo y que, al encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de una proteína, origina un color azul intenso que se puede medir fácilmente. Este método depende, pues de la interacción relativamenteinespecífica entre un colorante hidrofóbico y las proteínas, por lo que es relativamente sensible a la presencia de contaminantes tales como restos de detergente y líquidos orgánicos como el metanol. Su principal ventaja es que resulta más rápido y fácil de emplear que otros métodos alternativos, y más sensible que la medida de absorbancia a 280 nm. Este método es sensible (1-15 µg), simple, rápido, baratoy pocas sustancias interfieren en su determinación. Entre las sustancias que interfieren están los detergentes y las soluciones básicas. (5)
La electroforesis es la migración de iones en un campo eléctrico. La electroforesis de proteína se lleva a cabo en geles de agarosa o poliacrilamida con un tamaño de poro característico, de manera que la separación de las moléculas se basa en la filtraciónpor el gel (tamaño y forma) así como en la movilidad electroforética (carga eléctrica)l la SDS-PAGE es una forma de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) se utiliza el detergente dodecilsulfato de sodio (SDS). (6)
OBJETIVOS

Purificar la enzima Lactato Deshidrogenasa (LDH) a partir de músculo esquelético de pollo.
Conocer y aplicar las diferentes técnicas que se utilizan para la...