Practica De Microbiologia I-6

1) Dibuje los tipos de ELISA, explique brevemente el fundamento y ¿ cuál es su utilidad para el diagnóstico?

*ELISA directo
(ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparanrecubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra elantígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígenoen la solución analizada. Es necesario incluircontroles negativos que seránmuestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,...) pero en las que setenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyencontroles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado).

*ELISA indirecto
Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior. Loscontroles positivos y negativos son los mismos. Elsistema de detección emplea dosanticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra elprimario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación deseñal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario.Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues unmismo secundario marcado y un mismo sistema enzimáticopermite cuantificaruna gran cantidad de antígenos.

*ELISA sándwich
(Ensayo de captura de antígeno y detección medianteinmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre elpocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso deanticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, queserá retenido en el pocillo al ser reconocidopor el primer anticuerpo. Después deun segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución conun segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula deantígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundoanticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad ysensibilidad debido a la amplificación de señal que permiteel segundo anticuerpo.

2) En qué consiste y la utilidad del inmunoblot o western Blot.

Es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada (una mezcla compleja de proteínas, como un extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc.Luego son transferidas a una membrana adsorbente (típicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella.1 2 Finalmente, se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática, fluorescencia entre otros métodos.

3) Explique el fundamento de la reacción de polimerasa en cadena y sus aplicaciones.
*Fundamento:
Estatécnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse las hebras de ADN para que vuelvan a duplicarlas.
Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizadomediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción (ver más abajo). Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo quefavorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación sobre los tubos de reacción. Los termocicladores más antiguos que carecían de este sistema, solucionaban el problema de la condensación con una capa de aceite en la parte...