Practica deteccion de rotavirus por Western blot

Introducción:
La técnica de Western blot es un sistema rápido y muy sensible para la detección y caracterización de proteínas que se basa en la especificidad de reconocimiento entre antígeno y anticuerpo. Implica la separación por electroforesis en geles de poliacrilamida y una transferencia cuantitativa e irreversible a una membrana de las proteínas de una muestra compleja. Los antígenos quese han trasferido a la membrana son reconocidos por anticuerpos monoclonales específicos de ellos.
Western Blot es una técnica importante que se utiliza en Biología Celular y Molecular. Mediante el uso de una transferencia de Western, los investigadores son capaces de identificar proteínas específicas a partir de una mezcla compleja de proteínas extraídas de las células. La técnica utiliza treselementos para realizar esta tarea: (1) la separación por tamaño, (2) la transferencia a un soporte sólido, y (3) el marcaje de proteína diana utilizando un anticuerpo primario y secundario apropiado para visualizar.
Se puede hablar de dos tipos de Western Blog según el tipo de detección de proteínas: Directo: El anticuerpo primario marcado se une al antígeno de la membrana y reacciona con elsustrato originando una señal detectable. En el método directo de detección, el anticuerpo primario que se utiliza para detectar el antígeno sobre la superficie de la membrana, debe ir marcado con una enzima. Indirecto: El anticuerpo primario sin marcar reacciona con el antígeno. Luego, un anticuerpo secundario marcado se une al primario y reacciona con el sustrato. En el método indirecto, se añadeprimero un anticuerpo primario sin marcar contra el antígeno de la superficie de la membrana; posteriormente se añade un anticuerpo secundario marcado contra el anticuerpo primario.
Para entender la técnica del Western Blot es necesario comprender que es una electroforesis y en que se basa: Las proteínas suelen tener carga neta; por lo tanto, si se aplica un campo eléctrico a una solución quecontenga una mezcla de proteínas, éstas migrarán a una velocidad que dependerá de su carga neta, forma y peso molecular.
En cuanto al patógeno a detectar (indirectamente, pues se buscan anticuerpos contra éste), es el rotavirus, produce una infección intestinal o gastroenteritis, que es la causa más común de diarrea severa en niños, especialmente entre los 6 meses y 5 años de vida. En los casos másgraves, la deshidratación generada puede llegar a ser mortal. Los adultos también pueden infectarse, aunque la enfermedad tiende a ser leve, este virus es muy contagioso. Los síntomas son vómitos explosivos, diarrea acuosa a repetición, fiebre y dolor abdominal.
La reacción antígeno-anticuerpo es esencial en la respuesta inmunitaria del cuerpo humano, es la unión específica de un anticuerpo con unantígeno para inhibir o demorar su toxicidad, por lo que la presencia de anticuerpos en una muestra de suero, significa la presencia actual o pasada del antígeno (rotavirus).
Metodología:
SDS-PAGE
1. Preparar un gel de poliacrilamida al 11% (separador), mezclando los reactivos en un vaso de precipitado de 50 ml, en el orden que se indica en la tabla:
Reactivo
CantidadAcrilamida-Bisacrilamida 30%
1.83 ml
Tris-HCl 1.5 M pH 8.8
1. 25 ml
SDS 10%
50 l
Agua bidestilada
1.82 ml
AGITAR SUAVEMENTE
Persulfato de Amonio 10%
120 l
TEMED*
10 l
Volumen final
5 ml

2. Depositar los 3 ml de la mezcla de reactivos en el molde para preparar el gel y esperar 10 minutos para dejar polimerizar la acrilamida (cambio de líquido a semi-sólido).
3. Posteriormente, preparar un gel depoliacrilamida al 4% (concentrador) mezclando en un recipiente los reactivos que se indican en la tabla:

Reactivo
Cantidad
Acrilamida-Bisacrilamida 30%
0.5 ml
Tris-HCl 1 M pH 6.8
0.37 ml
SDS 10%
30 l
Agua bidestilada
2.02 ml
AGITAR SUAVEMENTE
Persulfato de Amonio 10%
60 l
TEMED*
5 l
Volumen final
3 ml

4. Tomar 1.5 ml de la mezcla y vaciar encima del gel separador, insertar...