PRACTICA ELECTROFORESIS DE PROTEINA EN GEL DE POLIACRILAMIDA

INTRODUCCION
Los geles de poliacrilamida constituyen un excelente medio de soporte para
Separaciones electroforéticas, dado que reúnen una serie de propiedades idóneas:
Transparencia, elasticidad, porosidad controlable y compatibilidad con una gran variedad de Compuestos químicos. La poliacrilamida se forma por copolimerización de dos
Compuestos, la acrilamida y la bis-acrilamida (N,N’-metilén-bis-acrilamida), en una
reacción iniciada por la tetrametiletiléndiamina (TEMED) y el persulfato de amonio. El
radical persulfato activa al TEMED, el cual a su vez activa al monómero de acrilamida para
que polimerice. Las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la bisacrilamida, formándose así una red de porosidad bastante uniforme, que puede ser regulada variando lascondiciones de la reacción y las concentraciones de los monómeros.
Entre las diversas técnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE, por sus
siglas en inglés "polyacrylamide gel electrophoresis"), probablemente la más utilizada es la modalidad que se lleva a cabo en presencia del detergente duodecilsulfato de sodio (SDSPAGE), tanto para analizar mezclas de proteínas, como para ser combinadacon técnicas de inmunoelectrotransferencia (Capítulo 14). En la ténica de SDS-PAGE, se mezclan las proteínas con el detergente aniónico SDS para formar complejos desnaturalizados, cargados negativamente. La cantidad de SDS unido a las proteínas es proporcional a su tamaño: el SDS se une en una proporción aproximada de 1,4 g SDS/g proteína. Los complejos proteína/SDS poseen una estructura elipsoideo de bastón, donde la cadena proteica es distendida y solubilizada por el detergente. Dado que la relación final carga/masa queda constante para las distintas proteínas (se anula su carga intrínseca), estas van a ser separadas en el gel poroso fundamentalmente con base en sus diferencias de peso molecular (PM): a menor tamaño, mayor movilidad de la proteína, y viceversa.

TEORIA
Laelectroforesis es una técnica de separación de moléculas cargadas por migración en un campo eléctrico. Las moléculas se separan en función de su carga eléctrica, desplazándose al electrodo de carga contraria y a mayor velocidad cuanto mayor es la carga de la molécula.
Cada molécula se desplaza en el campo eléctrico alcanzando una velocidad constante. En el estado estacionario, la fuerza impulsora (fuerzadel campo eléctrico) se equilibra con la resistencia al avance (fuerza de fricción hidrodinámica) en el medio en que se desplaza.
Se define la movilidad electroforética como la velocidad de desplazamiento por unidad de campo eléctrico. En unas condiciones determinadas de electroforesis, la diferente movilidad de cada molécula define su comportamiento y separación en el espacio. Diferentesmoléculas tendrán diferente movilidad electroforética en un medio determinado.
Hay tres tipos de electroforesis:
De frente móvil.
Zonal.
Continua.

Se pueden utilizar diferentes medios de soporte para evitar perturbaciones mecánicas y los efectos de las corrientes de convección en la separación. Como medios de soporte se pueden utilizar papel, acetato de celulosa, geles de almidón, geles deagarosa o geles de poliacrilamida.
Los geles de poliacrilamida son el resultado de la polimerización química de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. Controlando la concentración de ambas obtenemos geles de diferente grado de reticulación (diferente diámetro de poro).
Uno de los métodos de electroforesis más comúnmente aplicado para proteínas es el que emplea geles de poliacrilamida (PAGE =polyacrylamide gel electrophoresis) en presencia del detergente aniónico dodecilsulfato sódico (SDS). Est

Algunas características destacables de la electroforesis en geles de poliacrilamida son:

a) Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización de la acrilamida por acción de un agente entrecruzador ('cross-linking'), la bis-acrilamida en presencia de un iniciador y un...