Practica Electroforesis

TP5: Cuantificación de ADN y electroforesis en gel de agarosa
Objetivos
» Cuantificar el ADN extraído en el TP Nº4
» Identificar los productos obtenidos e interpretar las bandas resueltasmediante electroforesis
en gel de agarosa.
Introducción
Luego de la extracción del ADN, son necesarias la cuantificación y el análisis de la calidad
de las moléculas obtenidas.
Uno de losmétodos más utilizados para la cuantificación del ADN es el análisis de la
absorción UV, ya que los nucleótidos poseen máximos de absorción alrededor de 260 nm (por
ejemplo, dATP: 259 nm; dCTP: 272 nm;dTTP: 247 nm). Este método proporciona una estimación
simple y precisa de la concentración de una muestra, pero sólo si ésta se encuentra pura, sin
contaminación significativa de proteínas osolventes orgánicos que absorben a longitudes de onda
cercanas. Para evaluar la pureza de la muestra debe determinarse la proporción OD 260nm/OD
280nm. Si la relación es mayor a 1,6 puede estimarse quela muestra es lo bastante pura para
confiar en la cuantificación espectrofotométrica.
La calidad de las moléculas extraídas se analiza por electroforesis en gel de agarosa. La
agarosa es unpolisacárido altamente purificado derivado del agar. Se utiliza para separar
macromoléculas tales como ácidos nucleicos y grandes complejos proteicos. Tienen un menor
poder de resolución que lapoliacrilamida pero una gran rango de separación, tal que pueden ser
separadas moléculas de ADN desde 200 pb hasta aproximadamente 50.000 pb (variando las
concentraciones de agarosa). El tamaño delporo del gel puede ser predeterminado ajustando su
concentración en el gel; entonces a mayor concentración menor tamaño de poro. El rango de
trabajo es aproximadamente entre 0,7% y 2% p/v. Con ungel 0,7% se obtiene una buena
separación (resolución) de grandes fragmentos de ADN (5–10kb) y con uno 2% se resuelven
mejor los fragmentos pequeños (0.2–1kb). Hay que tener en cuenta que los...