Practica laboratori

METODOLOGIA I EXPERIMENTACIO EN BIOQUIMICA

Francisco Martínez Espinar
David Collado Fernández
Grup A3
INDEX

Determinació del contingut d’àcid ascorbic en suc de taronja 3
Determinació del contingut en sacarosa i glucosa en mostres de 7
Fraccionament subcel·lular: 11
Proteïnes 11
Quantificació de LDH 17
Determinació del contingut de proteína de la llet mitjançant el mètodeBradford 22
Quantificació de lípids totals en mostres de llet mitjançant el mètode Röse-Gottlieb 26
Determinació de triacilglicerols a la llet mitjançant el mètode GPO 28
Determinació del contingut de colesterol de l’ou 31

Determinació del contingut d’àcid ascorbic en suc de taronja

Introducció i objectius:
L’objectiu de la pràctica és determinar la quantitat d’àcid ascòrbic que hi haen dos mostres de suc de taronja: un natural i un comercial.
Per a fer-ho utilitzarem la sal de tetrazoli (MTT) la qual pot ser reduida per l’àcid ascòrbic i moltes altres substàncies reductores :
L-Ascorbat + altres substàncies reductores + MTT + PMS deshidroascorbat + formazà + H+
Per a trovar el L-Ascorbat haurem de fer un blanc en el que el AAO oxidarà al L-Ascorbat:
L-Ascorbat+ ½ O2 deshidroascorbat + H2O
El paràmetre del qual mesurarem l’absorbància será el formazà, a 578nm.

Procediment:
-Preparar dilució 1/10 de suc comercial o 1/6 del suc natural amb àcid metafosfòric 1,5% en els dos casos.
-Pipetejar dintre de 4 cubetes ( 2 per cada tipus de suc):

Solució | Blanc mostra | Mostra |
Solució 1 | 500 µL| 500 µL |
Aigua Millipore | 750 µL | 750 µL |
Mostra | 50 µL | 50 µL |
Espàtula AAO | 1/2 | 0 |

-Tapar-ho amb parafilm, agitar i incubar a 37ºC 10 min.(Agitar cada 2 min. mentres s’incuba)(S’ha de protegir de la llum en tot moment).
-Llegir absorbàncies a 578 nm (A1).
-Addicionar PMS (50 µL solució 3) a les cubetes.
-Deixar 15 min. en la foscor i llegir absorbància a 578nm(A2).
Resultats i qüestions:
Prenem nota del valors d’absoràncies obtingudes i els representem en una taula:
| A1 | A2 |
Blanc | | |
Suc natural | 0.335 | 1.038 |
Suc comercial | 0.357 | 1.090 |
Mostra | | |
Suc natural | 0.352 | 1.237 |
Suc comercial | 0.342 | 1.388 |


Suc natural:
Blanc- A2 - A1 = 1,038 – 0,335 = 0,703
Mostra A2 – A1 = 1,237 -0,532 = 0,885
Mostra – Blanc = 0,885 – 0,703 = 0,182

Suc comercial:
Blanc A2 - A1 = 1,090 – 0,357 = 0,733
Mostra A2 – A1 = 1,388 – 0,342 = 1,046
Mostra – Blanc = 1,046 – 0,733 = 0,313

Concentració suc natural:
Concentració= PME*d* ∆A*fe*F
On:
PM = pes molecular de la mostra = 176,13g/mol
d = pas de la llum = 1 cm
ℰ = coeficient d’absorció del MTT-formazà, a 578 nm = 16,9 * 103(M-1 * cm-1)
fc: factor de dilució en cubeta
F: factor de dilució de la mostra

Concentració= 176,1316,9 * 103*1* 0,182*135050*61=0,307 g/L

0,307 g/L = 30,7 mg / 100 ml de suc

Concentració suc comercial:
Concentració= PME*d* ∆A*fe*F

Concentració= 176,1316,9 * 103*1* 0,313*135050*101=0,8807 g/L

0,8807 g/L = 88,07 mg /100 ml de suc

Conclusions i comparació de resultats:

A totsels grups els hi ha donat més vitamina C en el comercial que en el natural. No obstant, els resultats són molt variats i s’allunyen de la realitat. Això pot haver estat degut a que a l’hora de esperar a mesurar l’absorbància, la mostra no la vam protegir de la llum i per tant es va anar oxidant. No obstant, això es veu només en el suc natural, ja que el suc comercial acostuma a portarantioxidants, que han evitat minimament aquest efecte.
Mirant, la mitja del suc natural, el nostre grup ens hem apropat molt a la realitat, ja que 100 ml de suc natural expremut, conté uns 50 mg de Vitamina C
Així doncs, d’aquesta pràctica no en podem treure masses conclusions, ja que en principi el suc que mes Vitamina C té, es el natural, i ens ha sortit al revés, possiblement per les raons explicades...