practicas bioquimica

TRIGLICERIDOS
Método GPO-PAP

Dos moléculas de AcilCoA formada a partir de ácidos grasos, se combinan con el glicerol 3-fosfato, para formar fosfatidato(P de 1,2 diacilglicerol) por un conjunto de enzimas convierte el fosfatidato en 1-2 diacilglicerol y luego en triglicérido
Los triglicéridos son esteres de alcohol glicerol y Ac. Grasos

METODO COLORIMETRICO.
Los triglicéridos sedeterminan a partir de la hidrólisis enzimatica con lipasas. El indicador es una quinoneimina formada por hidrogeno peroxido, 4-aminofenazona y 4-clorófenol, bajo la influencia catalítica de peroxidasa.

PRINCIPIO
Triglicéridos + H2O -----> glicerol + ácidos grasos
Glicerol + ATP ------> glicerol-3-fosfato + ADP
Glicerol-3-fosfato O2 -------> dihidroxiacetona + H2O2
2H2O2 + 4-aminofenazona +4clorofenol------> quinoneimina + HCL + 4H2O

MUESTRA.
Suero, plasma heparinizado o EDTA plasma.

PREPARACION DE LOS REACTIVOS
R1a. Tampón
Listo para usar. Estable hasta la fecha de caducidad cuando se conserva entre +2 y +8°C

R1b. Reactivo enzima
Reconstituir un vial de reactivo enzima R1b Cat. TR210 con 15 ml de tampón R1a..
Reconstituir un vial de reactivo enzima R1b Cat. TR213 con unpequeño volumen de tampón R1a y después transferir todo el contenido al frasco R1a, enjuagando el vial R1b varias veces. Los reactivos son estables durante 21 días entre +2 y +8°C o 3 días entre +15 y +25°C protegidos de la luz.

CAL. Patrón
Listo para usar. Estable hasta la fecha de caducidad cuando se conserva entre +2 y +8°C

PROCEDIMIENTO
Longitud de onda: 500nm, Hg 546nm
Cubeta: 1cm deespesor
Temperatura de espesor: 20-25°C o 37°C
Medición: Frente a reactivo Blanco

Pipetear en tubos de ensayo:


Reactivo Blanco
Patrón
Muestra
Muestra
-------
-----
10µl
Patrón
-------
10µl
-----
Reactivo
1000µl
1000µl
1000µl





Mezclar incubar durante 10 minutos a 20-25°C o 5minutos a 37°C. Medir la absorbancia de la muestra (Amuestra) y del patrón (Apatron) frente al reactivo blanco antes de 60 minutos.

CALCULO
1. Utilizando el patrón:
Conc. Triglicéridos = Abs. muestra X 200= mg/dl
Abs. patron

2. Utilizando factor
Concentración de triglicéridos
Longitud de onda mmol/l mg/dl
Hg 546nm 11.95 1048
500nm 8.47 743

VALORESDE REFERENCIA
Se recomiendan los siguientes límites para establecer el factor de riesgo de hipertrigliceridemia:

Sospechado a partir de: 1.71nmol/l o 150mg/dl
Aumentado a partir de: 2.29nmol/l o 200mg/dl






























UREA BERTHELOT
Método Berthelot Modificado

Diferentes animales excretan el exceso de nitrógeno como amoniaco, Ac. Úrico, ourea. La biosíntesis de la urea se efectúa en cuatro etapas.
1).- Transaminacion.
2).- Desaminacion oxidativa.
3).- Transporte de amoniaco.
4).- Reacciones del ciclo de la urea

METODO COLORIMETRICO
PRINCIPIO
El método se basa en la reacción siguiente:

Urea + H2O --------> 2 NH3 +CO2

El salicilato de hipoclorito del reactivo reacciona con los iones de amonio para formar un complejoverde (2,2 dicarboxilindofenol).

MUESTRA
Suero, plasma hiperinizado o citrado, EDTA plasma u Orina. Diluir la orina 1 +20 con agua destilada. Multiplicar el resultado por 21.

REACTIVOS
Componentes
R1a. Ureasa
R1b. Tampón fosfato
Salicilato sodico
Nitroprusiato sodico
EDTA
R2. Hipoclorito
Hidróxido sodico
CAL. Patrón

PREPARACION DE LAS SOLUCIONES
UreasaR1a. Tampón Fosfato R1b, Hipoclorito Sodico Ra y CAL. Patron se suministran listos para usar. Estables hasta la fecha de caducidad cuando se conservan entre +2 y +8°C

ESTABILIDAD Y PREPARACION DEL REACTIVO DE TRABAJO R1
Añadir un vial de Ureasa R1a. a un vial de tampón fosfato R1b. Estable durante un mes cuando se conserva a una temperatura de +2 a +8°C protegido de la luz.

PROCEDIMIENTO...