Practicas de bioquímica clínica

Prácticas No. 1 García Jacobo Rocío Edith Miranda Castro Neyra Yadira Rojero Franco Karina Fecha: 15 de febrero del 2011

CUANTIFICACIÓN DE LOS NIVELES SÉRICOS DE GLUCOSA a) Determinación de la glucosa en ayunas. b) Determinación de glucosa postprandial. OBJETIVOS  Realizar la determinación en suero de glucosa por medio de la técnica enzimática-colorimétrica, para la valoración de lasalteraciones del metabolismo de los carbohidratos. Determinar la glucosa postprandial, por medio de la técnica enzimáticacolorimétrica, para valorar la capacidad del organismo para metabolizar esta monosacárido.

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INTRODUCCIÓN Las determinaciones de glucosa son fundamentales en el diagnóstico y tratamiento de las enfermedades relacionadas con el metabolismo de los hidratos de carbono y se realizanen sangre total, plasma, suero, LCR, líquido pleural y orina. Métodos para la determinación de glucosa: La mayoría de las mediciones de glucosa se besan en métodos enzimáticos. Estos métodos enzimáticos tienen gran especificidad y pueden ser adaptados para realizar determinaciones en los puntos de atención médica. Actualmente, las determinaciones de glucosa se realizan mediante tres sistemasenzimáticos: glucosa-deshidrogenasa, glucosa –oxidasa y hexocinasa. En algunos métodos, la reacción produce una corriente eléctrica proporcional a la cantidad de analito. Otros métodos se basan en el cálculo de la variación de la velocidad inicial de reacción, que depende de la glucosa presente inicialmente, o bien puede tratarse de ensayos a punto final. El método de la glucosa-deshidrogenasa, laglucosa es utilizada para reducir un cromóforo que permita ser medido espectrofotométricamente (Ec. 11-1) o para generar una corriente eléctrica (Ec. 11-2).

La glucosa oxidasa es un aflavoenzima que cataliza las reacciones descritas a continuación. La reacción de la peroxidasa puede medirse espectrofotométricamente (Ec. 11-3) y de inhibe con concentraciones altas de ácido úrico, acido ascórbico,bilirrubina, glutatión, creatinina, L-cisteína, L-dopa, dopamina, metildopa y ácido cítrico.

La prueba de la hexocinasa está aceptada como el método de referencia para la determinación de glucosa. La reacción se muestra en la Ec. 11-6. La concentración de glucosa es proporcional al índice de producción de NAD(P)H, medido espectrofotométricamente. Dependiendo de la fuente deglucosa-.6-fosfatodeshidrogenasa, la enzima puede ser específica para el NADP o utilizar además NAD. Las muestras hemolizadas pueden crear problemas, ya que el contenido d liberado de los eritrocitos puede interferir en la relación estequiometrica entre la glucosa y la acumulación de NAD(P)H.

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MATERIALES Y MÉTODOS Se extrajeron aproximadamente 3mL de sangre periférica de un paciente en ayunas y se colocó en untubo 13x100 sin anticoagulante. Enseguida se centrifugó a 3000rpm durante cinco minutos. Se separó el suero en un tubo eppendorf con ayuda de una pipeta Pasteur. Después al mismo paciente se le administró vía oral una solución glucosada de 75g/dL, y al cabo de dos horas se le extrajeron nuevamente 3mL de sangre periférica (posprandial) en un tubo 13x100 sin anticoagulante, y se llevó a cabo elmismo procedimiento. Se marcaron cuatro tucos 13x100mm, como blanco, patrón, muestra 1 (ayunas), y muestra 2 (posprandial). Se adicionaron, con una micropipeta, en el respectivo tubo 6µL de agua destilada, patrón, muestra 1 y muestra 2. Se adicionaron también con micropipeta 600µL de reactivo R y se homogenizó. Se incubó durante 10 minutos a 37°C. Se leyó absorbancia a una longitud de onda de 500nmdel patrón y las muestras contra el blanco. RESULTADOS Muestra 1= Glucosa plasmática en ayunas Muestra 2= Glucosa plasmática después de la ingestión de alimentos

Tipo de muestra Patrón Muestra 1 Muestra 2

Absorbancia 0.048 0.052 0.043

Cálculos para la concentración de glucosa

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Tiempo (min) []de Glucosa Patrón M1 M2 0 5 120

[] de Glucosa 100 108,33 89,59

Curva de tolerancia...