Practicas

SEMICONSERVATIVA Meselson y Stahl cultivaron celulas de E. coli durante varias generaciones en un medio cuya única fuente de nitrogeno (NH4Cl) contenía 15N , el isotopo pesado del nitrogeno, en lugar del isotopo ligero normal y mas abundante, el 14N. El DNA aislado de estas células tenía una densidad un 1% mayor que el DNA normal; aunque la diferencia es pequeña, se puede separar la mezcla porequilibrio de sedimentación en gradiente de densidad de cloruro de cesio. Células de E. coli cultivadas en medio con 15N se transfirieron a un medio que contenía solamente el isotopo 14N, donde se las dejó crecer hasta la duplicación de la poblacion celular. El DNA aislado de esta primera generación de células formó una única banda en el gradiente de cloruro de cesio en una posición que indicaba quelas moléculas de DNA de doble helice de las celulas hijas eran hibridos que contenian una cadena nueva con 14N y una cadena parental con 15N. Este resultado contradecía la replicación conservadora, una hipotesis alternativa segun la cual una molecula de DNA de la progenie estaria formada por dos cadenas de DNA recien sintetizadas, mientras que la otra contendria las dos cadenas parentales; estemecanismo no daria moleculas de DNA hibridas en el experimento de Meselson y Stahl. La hipotesis de la replicacion semiconservadora se confirmo en la siguiente etapa del experimento; se permitio que las celulas volviesen a doblar su numero en el medio con 14N. El DNA aislado de este segundo ciclo de replicacion mostro dos bandas en el gradiente de densidad, una con una densidad igual a la del DNAligero y la otra del DNA hibrido observado despues de la primera duplicacion celular. BIDIRECCIONAL Cairns incorporó radiactividad en el DNA de E. coli, cultivando las celulas en un medio que contenia timidina marcada con tritio 3H. El DNA cuidadosamente aislado y extendido, fue cubierto con una emulsion fotografica durante varias semanas. La desintegracion del 3H de la timidina impresiono laemulsion, formando una imagen de la molecula de DNA. Estas imagenes mostraron que el cromosoma intacto de E. coli es gran circulo sencillo de una longitud de 1.7 mm. El DNA radiactivo aislado de celulas en proceso de replicacion mostro un lazo extra; Cairns llego a la conclusion de que el lazo en el DNA era el resultado de la formación de dos cadenas hijas radiactivas, cada una complementaria a lacadena parental. Uno o ambos extremos del lazo son puntos dinamicos llamados horquillas de replicacion, donde el DNA parental es desenrollado y las cadenas separadas son rapidamente replicadas. Los resultados demostraron que las dos cadenas se replican de manera simultanea. Una variante de este experimento indicó que la replicacion de los cromosomas bacterianos es bidireccional; los dos extremos dellazo tienen horquillas de repliacion activas. UNICO ORIGEN DE REPLICACION Para determinar si los lazos se originan en un unico punto del DNA , se necesitaban señales de referencia a lo largo de la molecula de DNA. Estas señales las proporciono una tecnica denominada cartografiado por

desnaturalizacion, desarrollada por Ross Inman y colaboradores. Utilizando el cromosoma del bacteriofago lambdade 48 502 pares de bases, Inman demostró que las secuencias ricas en pares de bases A=T pueden ser desnaturalizadas selectivamente. Las regiones desnaturalizadas forman burbujas de cadena sencilla; de forma similar se pueden desnaturalizar parcialmente DNA aislados que contengan bucles de replicación. Es posible medir la posicion y el progreso de las horquillas de replicacion utilizando lasregiones desnaturalizadas como puntos de referencia. Esta tecnica revelo que los lazos de replicacion siempre se inician en un punto unico denominado origen. DIRECCIÓN DE LA SINTESIS DE DNA ... Una de las cadenas es sintetizada de modo continuo y la otra de modo discontinuo. La cadena continua o cadena conductora es aquella cuya sintesis en direccion 5'-3' transcurre en la misma direccion que el...