Practico de laboratorio, PCR



Practico nº 9
PCR
(Polimerase Chain Reaction)













Introducción
La reacción en cadena de la polimerasa más conocida como PCR, es una técnica de biología molecular que tiene como objetivo una rápida replicación de DNA. Esta técnica es usada en diversas áreas de la ciencia desde que se inventó en 1983 por Kary Mullis, ya que permite la obtención de miles hasta millonesde copias de DNA con una pequeña muestra de DNA base y en unas horas, así permitiendo la detección de marcadores moleculares, secuencias alélicas, etc.
La tecnología del PCR ha permitido avances científicos significativos, incluyendo la huella dactilar del DNA y la secuenciación del genoma humano. Además ha influido de forma importante en el área de la medicina con la detección de enfermedades,estudio de enfermedades genéticas. También ha sido de gran ayuda en el área forense ya que la amplificación de DNA con pocas muestras de tejido, hace que se pueda contar con una mayor cantidad e identificar sospechosos comparando frecuencias alélicas o parentales con lo encontrado en la escena del crimen.
Este método en el área de la genética ha ayudado la identificación de secuencias alélicas anivel de poblaciones, que podrían servir para identificar ciertos genotipos que producen fenotipos particulares en poblaciones determinadas, o análisis de secuencias codificantes que produzcan enfermedades y puedan ser detectadas para ver las posibilidades de que la padezca.
En la biología molecular, esta técnica ha facilitado muchas investigaciones que no hubieran podido ser de esa manera sinla técnica de replicación del DNA a través de DNA polimerasa.
En este laboratorio, emplearemos la técnica de PCR para el análisis del cromosoma 16, en busca de la secuencia ALU en el locus PV92 para el análisis de población en comparación con una población de EEUU respecto a la predominancia de esta secuencia en el genoma de la clase de BIO133.





Objetivo del práctico

El objetivo deeste práctico es el aprender el funcionamiento, y uso de la técnica de PCR a nivel de genética de poblaciones analizando una secuencia presente en nuestros genomas llamada secuencia ALU y determinar en qué nivel está en la población del BIO133.















Metodología
Obtención de muestra biológica (ADN)
1) Cada integrante del grupo deberá etiquetar un tubo el cual contiene200 ul de intagene matrix con sus respectivas iniciales.
2) Todos los integrantes del grupo deberán proporcionar una muestra biológica (saliva) la cual será depositada en un vaso.
3) Transfiera 1 ml de la solución anterior a un tubo eppendorff.
4) Centrifugar el tubo a máxima velocidad durante 2 minutos. Una vez acabado retire el tubo y observe la presencia de un pellet de células
5) Una vezobtenido el pellet retire el sobrenadante, luego poner en un vortex
6) transfiera 20 micro litros de la sustancia anterior.
7) Una vez todos hayan terminado, poner los tubos en una gradilla de espuma a un baño a 56 ºC durante 10 minutos. En la mitad del proceso retirar la gradilla y mezclar el contenido, una vez terminado volver a poner la gradilla en el baño.
8) Retirar los tubos del baño,mezclar el contenido del tubo. Ahora poner la gradilla en un baño a 100 ºC durante 6 minutos
9) una vez acabado el tiempo retirar los tubos del baño, mezclar suavemente y luego someter a la centrifuga durante 5 minutos a 6000g.
PCR
1) Una vez terminado el proceso anterior refrigere las muestras, sacar las muestras y centrifugar por 2 minutos a 2000g.
2) Transferir 10 ul del sobrenadante deltubo con ADN al tubo de PCR
3) Agregar al tubo de PCR 10 ul de red gel y mezclar, luego poner una gota de aceite mineral sobre la solución
4) Colocar los tubos de PCR en hielo, hasta que se indique ponerlo en el termociclador
Electroforesis
1) Colocar los tubos de PCR en el adaptador y centrifugar por 3 seg. A 2000g
2) Agregue 5 ul del tampón de carga PV92 XC a cada tubo de PCR, agitar...