Practico N 3 bioquimica 1



Practico N°3.

Cuantificación por Espectrofotometría.









Integrantes: Karina Antúnez.
Aracely Apablaza.
Carla Benavides.
YasnaPérez.
Ramo: Bioquímica.
Profesora: Sra. Susana Flores.




Obstetricia y Puericultura, sección 1.
Talca, 5 de octubre 2013.
Diseño experimental:


Reactivos

Estándar de BSA (albumina de suero debovino) 100 mg/ml
Reactivo de Bradford

Muestras Biológicas

Extracto proteínico (muestra de leche descremada industrial)

Materiales/Equipos

Tubos
Pipeta de 5 ml
Vortex
Gradilla para tubo de ensayosEspectrofotómetro/cubetas
Vaso de precipitado de 50 ml


Metodología:

A. Construcción de la curva de calibración:
1.-Prepare diluciones de proteína estándar (BSA) a partir de solución de stock 0,5ug/ul.
a. Numere 5 tubos eppendorf de 1.5 ml.
b. Agregue las cantidades de agua y albumina señaladas en la tabla.

Tubo
Albumina (ul)
Agua (u)
Ug prot. Totales
Absorbancia.
1
200
700
100
0.868
2
100800
50
0.555
3
40
860
20
0.392
4
20
880
10
0.317
5
0
900
0
Blanco.

1. Agregue a cada tubo 100 ul de solución Bradford.
2. Mezcle bien y espera al menos 5 min para que se forme completamente elcolor.
3. Mida la D.O. a 595 nm, a partir de la más diluida a la más concentrada, de modo de poder utilizar la misma cubeta para todas las mediciones.
4. Graficar Absorbancia a 595 nm versus laconcentración del estándar.


B. Calculo de la concentración de proteínas en su muestra:

1. Prepare la muestra tomando 100 ul de muestra y combínela con 800 ul de agua destilada.
2. Agregue 100 ul de solución deBradford.
3. Mezcle bien y espere al menos 5 min para que se forme completamente el color.
4. Mida la densidad óptica a 595 nm.
5. Calcule el coeficiente de extinción molar por interpolación directadel grafico y a partir de la ecuación de la recta.

Desarrollo:

4.- La densidad óptica medida a 595 nm es de 0.512.


A= E * C * L 0.512=E 0,2622 1

E = 0,512
__________
0,2622 1...