Pre reporte biologia molecular

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
ACADEMIA DE BIOQUÍMICA
CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS
PRÁCTICA Nº 4
“EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN ELECTROFORETICA DE PLASMIDOS BACTERIANOS”

ALUMNOS:
LUÉVANO RODRÍGUEZ DIANA LAURA

CARRERA: LIC. EN ANÁLISIS QUÍMICO BIOLÓGICOS.
6º SEMESTRE

PROFESOR: M.C. LUCÍA ISABEL CHÁVEZ ORTIZ
TÉCNICO: MC ROSALBA BEAS FERNÁNDEZ

FECHA DE ENTREGA: 21 DE MARZO DE 2011

PRÁCTICANº4
“EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN ELECTROFRETICA DE PLASMIDOS BACTERIANOS”
OBJETIVO (S):
Al término de la práctica el alumno conocerá un método de extracción y purificación de plásmidos bacterianos.
INTRODUCCIÓN:
La síntesis de un DNA recombinante abre el camino para la producción de cantidades importantes de fragmentos de DNA. Mediante la incorporación de un DNA recombinante a un sistemacelular que permita la replicación del DNA recombinante, puede conseguirse la amplificación del DNA. Para ello se utiliza una DNA portador, denominado vector de clonación. Los plásmidos bacterianos son ideales como vectores de DNA recombinante.
Muchas bacterias contienen un único cromosoma circular de aproximadamente 4 millones de pares de bases y moléculas de DNA minicircular denominadas plásmidos.Los plásmidos están compuestos normalmente sólo por unos pocos miles de pares de bases, y raramente están asociados con la gran molécula cromosómica. Los genes contenidos en el plásmido cumplen varias funciones; entre ellas, la capacidad de conferir a la bacteria resistencia a los antibióticos, una característica útil para la selección de colonias específicas de la bacteria. Los plásmidos sereplican independientemente de la replicación del cromosoma bacteriano principal. Un tipo de plásmidos, los plásmidos de control relajado, pueden estar presentes desde decenas a cientos de copias por bacteria, y la replicación depende solamente de las enzimas de la célula huésped de larga vida media. Por lo tanto, la replicación de los plásmidos “relajados” puede producirse en presencia de uninhibidor de la síntesis de proteínas. En estas condiciones, las bacterias pueden acumular varios millares de copias del plásmido por célula. Otros tipos de plásmido están sujetos a control estricto y su replicación depende de la síntesis continua de proteínas codificadas en el plásmido.
Estos plásmidos se replican aproximadamente a la misma velocidad que el cromosoma bacteriano, y sólo se encuentra unbajo número de copias por célula. Los plásmidos relajados se utilizan rutinariamente en estudios de recombinación. El primer DNA recombinante útil que logró clonarse fue fruto de la ligación de un DNA foráneo con un vector, el plásmido pSC101 de E. coli, que contiene un único sitio para la endonucleasa de restricción EcoRI y un gen que codifica una proteína que confiere a la bacteria resistencia aun antibiótico. Este plásmido contiene un origen de replicación y secuencias de DNA reguladoras asociadas, que en conjunto se conocen como un replicón. Sin embargo, este vector presenta numerosas limitaciones. El sitio de restricción único limita los fragmentos de DNA que pueden clonarse a aquellos que hayan sido generados por EcoRI y la resistencia a un antibiótico como único marcadorseleccionable reduce su utilidad; además, se replica con dificultad.
Mediante la tecnología del DNA recombinante, se han construido vectores plámídicos de gran versatilidad. Las características deseables de un vector plasmídico son: un tamaño relativamente pequeño (3-5kb) para poder acomodar fragmentos más grandes; varios sitios de restricción diferentes para la clonación de una amplia variedad defragmentos; múltiples marcadores seleccionables para facilitar la selección de bacterias con moléculas de DNA recombinante; y elevada velocidad de replicación. El primer plásmido que se construyó para satisfacer estos requerimientos fue el pBR322, que se ha utilizado como base para la construcción de nuevos vectores actualmente en uso. La mayoría de los vectores habitualmente utilizados contiene una...