Precipitacion de proteinas


In this practice demonstrates the properties of the proteins that can be modified to manipulate for the study of thereof and for the purification of these. We also study the effects of metals for protein precipitation and modify the pH in a solution of insulin for understand a little more the isoelectric point.
INTRODUCCIÓN
Las células contienen miles de proteínas. La preparación pura de unaproteína es esencial antes de determinar sus propiedades, composición de aminoácidos y secuencia. Los métodos de separación de proteínas aprovechan las propiedades fisicoquímicas de estas.
La solubilidad de la mayor parte de las proteínas se debe a la interacción hidrófilica de las moléculas polares del agua y los grupos ionizados de las proteínas.
Existen diversos factores (pH, temperatura,fuerza iónica, constante dieléctrica del disolvente) que afectan la solubilidad de las proteínas la modificación de estos parámetros en soluciones proteicas heterogéneas, permite purificarlas en virtud de su solubilidad.
OBJETIVOS
El alumno observara el efecto que producen algunos agentes fisicoquímicos sobre la solubilidad de las proteínas.
El alumno determinara el punto isoeléctrico de lainsulina basándose en las propiedades de solubilidad a diferentes valores de pH.
MATERIAL Y MÉTODO
Gradilla, tubos de ensayo, pipetas de 1.5, 5 y 10ml, vaso de precipitado, jeringas para insulina, probeta de 100ml, centrifuga, embudo de filtración, algodón, agitador de vidrio.
Separación de proteínas por precipitación con sales (salting out).
6ml de clara diluida 3:1 + 6ml de sol. Saturada de sulfatode amonio, centrifugar a 2500 rpm 15 min. resuspender el precipitado en 2ml de H2O destilada realizar reacción de Biuret, tomar 1ml del filtrado y hacer reacción de Biuret, tomar 5ml de filtrado + sulfato de amonio solido hasta saturación, filtrar, al filtrado y al precipitado realizar reacción de biuret
Precipitación por efecto del pH y de solventes

Preparar una serie de tubos de acuerdo a latabla de “Precipitación por efecto del pH y de solventes”

Precipitación de proteínas por metales pesados
Preparar una serie de tubos de acuerdo a la tabla de
“Precipitación de proteínas por metales pesados”
Determinación del punto isoeléctrico de la insulina
Preparar una serie de tubos de acuerdo a la tabla de
“Determinación del punto isoeléctrico de la insulina”
RESULTADOS
Tabla de “SaltingOut”


Biuret
Interpretación
Filtrado 1
Positiva
Formación de color violáceo
Precipitado 1
Positiva
Formación de color violáceo
Filtrado 2
Positiva
Formación de color violáceo
Precipitado 2
Positivo
Formación de color violáceo











Tabla “Precipitación por efecto del pH y de solventes”

TUBO No
1
2
3
Clara de huevo (ml)
3.0
3.0
3.0
HCl 0.1 N (ml)
1.0
-
-
NaOH 0.1 N (ml)
-
1.0
-
Regulador deacetatos 0.1 M pH 4.7 (ml)
-
-
1.0
Observaciones

+

---

++

Etanol 96º (ml)
3.0
3.0
3.0
Observaciones
+++
---
+++

--- No hay precipitación
+ Precipitación parcial
++ Turbidez
+++ Precipitación total


Tabla “Precipitación de proteínas por metales pesados”

i. + Precipitación.
ii. --- No hay precipitación




Tabla “Determinación del punto isoeléctrico de la insulina”

1.- Calculos de lospH


Tubo No. 1

Tubo No. 2

Tubo No. 3

Tubo No. 4



Tubo No. 5


ANÁLISIS DE RESULTADOS
Separación de proteínas por precipitación con sales (salting out).
Al realizar las pruebas de Biuret nos dio positivo en el primer filtrado y primer precipitado debido a que no se realizo ningún tratamiento de separación de proteínas por lo tanto las proteínas seguían presentes en ambas soluciones.
Elrealizar la 2 prueba de Biuret nos dio positivo en ambas también esto se debió a que la filtración no se llevo a cabo por el uso de papel filtro con poros muy grandes y por lo tanto el filtrado contenía la misma cantidad de proteínas con y sin filtrado.
Precipitación por efecto del pH y de solventes.
En las pruebas de precipitacion el precipitado se presentó mayor junto con una turbidez de la solución...