preparaación adn plasmidico
Páginas: 7 (1646 palabras)
Publicado: 15 de agosto de 2014
T.P Nº2 Preparación de ADN plasmídico de Escherichia Coli
Objetivo:
Extraer ADN plasmídico (pBluescript II SK/KS) de cepa bacteriana DH5α E. Coli, bacteria gram negativa, a partir de un pellet de estas bacterias previamente crecidas en un medio rico en nutrientes.
Destacamos, de este plásmido, algunos de los elementos de mayor relevancia para las actividades que realizaremos en lossiguientes TPs:
1. ORI o Rep (pMB1): origen de replicación de alto número de copias.
2. Gen bla (ApR) de resistencia a antibiótico (ampicilina): Codifica para la β-lactamasa, la cual es una enzima capas de degradar la ampicilina permitiéndole de este modo a la bacteria sobrevivir y crecer en un medio en presencia de este antibiótico.
3. Polylinker o sitio múltiple de clonado (MCS): región de sitiosde restricción únicos agrupado en un vector de clonación.
Métodos y Procedimientos
Utilizamos como método la lisis alcalina
Para realizar este método relizamos las siguientes operaciones:
1. se nos entregó un tubo eppendorf, un pellet de 1,5 ml de un cultivo bacteriano en fase estacionaria de una cepa de E. coli conteniendo un plásmido de alto número de copias, resuspendido en 0,3 ml dela Solución 1.
2. Agregamos 0.3 ml de Solución 2 y mezclamos inmediatamente por inversión. Incubamos a temperatura ambiente por no más de 5 min. La suspensión bacteriana, turbia, se volvió transparente y viscosa.
3. Agregamos 0.3 ml de Solución 3 (en hielo) y mezclamos inmediatamente por inversión. La solución pasó de transparente a turbia.
4. La solución fue llevada a centrifugar 15 min amáxima velocidad.
5. Transferimos el sobrenadante a otro eppendorf.
6. Agregamos isopropanol (a temperatura ambiente) hasta llenar el tubo (0.6 - 0.7 ml). Mezclamos por inversión.
7. Centrifugamos 30 min a máxima velocidad.
8. Descartamos el sobrenadante. Agregamos 500 μl de etanol 70%, mezclamos suavemente por inversión para que se despegue el pellet y se lave.
9. Centrifugamos 5 min amáxima velocidad. Descartamos el sobrenadante con pipeta y eliminamos las gotas que quedaban con P200.
10. Dejamos secar el pellet 5-10 min con la tapa del tubo abierta hasta que el pellet paso de blanco a transparente.
11. Resuspendedimos el pellet en 20 μl de agua MilliQ.
12. Guardamos a -20°C.
Resultados y conclusiones:
En el paso 7 luego de la centrifugación de 30 minutos obtuvimos uneppendorf que en su fondo tenía un pellet de color blanco, el cual correspondería al ADN plasmidico, y observamos una parte de color negro, la cual no supimos a que se debía aunque dedujimos que se trataba de una impureza contraída del medio.
Cuestionario:
1. ¿Son esenciales los plásmidos para la supervivencia de la bacteria?
Los plásmidos no son esenciales para la supervivencia de labacteria pero confieren ventajas al hospedador en condiciones de crecimiento determinadas gracias a que contienen genes que le otorgan características adicionales.
2. ¿Qué es la incompatibilidad plasmídica?
La incompatibilidad plasmídica es el conjunto de los plásmidos que no pueden coexistir en una misma bacteria debido a que comparten parte de la maquinaria replicativa y por lo tanto partedel mecanismo de represión. Esto genera competencia entre los plásmidos dentro de la célula provocando asi que luego de sucesivas generaciones uno de ellos logre establecerse y excluir al otro del interior de la célula.
3. ¿Cuáles son los usos que se le dan a los plásmidos en biología molecular y celular?
En biología molecular y celular los plásmidos pueden ser utilizados comovectores de clonado. Se les agrega una secuencia de ADN genómico el cual se quiere clonar y amplificar, las bacterias con el plásmido vector son transformadas y luego se plaquean en un medio sólido, generando de esta manera la formación de nuevas colonias provenientes de la bacteria modificada. Si el plásmido tiene un Ori de alto número de copias se logra amplificar el inserto como consecuencia de...
Objetivo:
Extraer ADN plasmídico (pBluescript II SK/KS) de cepa bacteriana DH5α E. Coli, bacteria gram negativa, a partir de un pellet de estas bacterias previamente crecidas en un medio rico en nutrientes.
Destacamos, de este plásmido, algunos de los elementos de mayor relevancia para las actividades que realizaremos en lossiguientes TPs:
1. ORI o Rep (pMB1): origen de replicación de alto número de copias.
2. Gen bla (ApR) de resistencia a antibiótico (ampicilina): Codifica para la β-lactamasa, la cual es una enzima capas de degradar la ampicilina permitiéndole de este modo a la bacteria sobrevivir y crecer en un medio en presencia de este antibiótico.
3. Polylinker o sitio múltiple de clonado (MCS): región de sitiosde restricción únicos agrupado en un vector de clonación.
Métodos y Procedimientos
Utilizamos como método la lisis alcalina
Para realizar este método relizamos las siguientes operaciones:
1. se nos entregó un tubo eppendorf, un pellet de 1,5 ml de un cultivo bacteriano en fase estacionaria de una cepa de E. coli conteniendo un plásmido de alto número de copias, resuspendido en 0,3 ml dela Solución 1.
2. Agregamos 0.3 ml de Solución 2 y mezclamos inmediatamente por inversión. Incubamos a temperatura ambiente por no más de 5 min. La suspensión bacteriana, turbia, se volvió transparente y viscosa.
3. Agregamos 0.3 ml de Solución 3 (en hielo) y mezclamos inmediatamente por inversión. La solución pasó de transparente a turbia.
4. La solución fue llevada a centrifugar 15 min amáxima velocidad.
5. Transferimos el sobrenadante a otro eppendorf.
6. Agregamos isopropanol (a temperatura ambiente) hasta llenar el tubo (0.6 - 0.7 ml). Mezclamos por inversión.
7. Centrifugamos 30 min a máxima velocidad.
8. Descartamos el sobrenadante. Agregamos 500 μl de etanol 70%, mezclamos suavemente por inversión para que se despegue el pellet y se lave.
9. Centrifugamos 5 min amáxima velocidad. Descartamos el sobrenadante con pipeta y eliminamos las gotas que quedaban con P200.
10. Dejamos secar el pellet 5-10 min con la tapa del tubo abierta hasta que el pellet paso de blanco a transparente.
11. Resuspendedimos el pellet en 20 μl de agua MilliQ.
12. Guardamos a -20°C.
Resultados y conclusiones:
En el paso 7 luego de la centrifugación de 30 minutos obtuvimos uneppendorf que en su fondo tenía un pellet de color blanco, el cual correspondería al ADN plasmidico, y observamos una parte de color negro, la cual no supimos a que se debía aunque dedujimos que se trataba de una impureza contraída del medio.
Cuestionario:
1. ¿Son esenciales los plásmidos para la supervivencia de la bacteria?
Los plásmidos no son esenciales para la supervivencia de labacteria pero confieren ventajas al hospedador en condiciones de crecimiento determinadas gracias a que contienen genes que le otorgan características adicionales.
2. ¿Qué es la incompatibilidad plasmídica?
La incompatibilidad plasmídica es el conjunto de los plásmidos que no pueden coexistir en una misma bacteria debido a que comparten parte de la maquinaria replicativa y por lo tanto partedel mecanismo de represión. Esto genera competencia entre los plásmidos dentro de la célula provocando asi que luego de sucesivas generaciones uno de ellos logre establecerse y excluir al otro del interior de la célula.
3. ¿Cuáles son los usos que se le dan a los plásmidos en biología molecular y celular?
En biología molecular y celular los plásmidos pueden ser utilizados comovectores de clonado. Se les agrega una secuencia de ADN genómico el cual se quiere clonar y amplificar, las bacterias con el plásmido vector son transformadas y luego se plaquean en un medio sólido, generando de esta manera la formación de nuevas colonias provenientes de la bacteria modificada. Si el plásmido tiene un Ori de alto número de copias se logra amplificar el inserto como consecuencia de...
Leer documento completo
Regístrate para leer el documento completo.