Preparación Master Mix Sybr Green

UNIVERSIDAD POLITÉCNICA SALESIANA
ÁREA EN CIENCIAS DE LA VIDA
INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA DE LOS RECURSOS NATURALES

“CÁTEDRA DE BIOTECNOLOGÍA GENERAL”

INTEGRANTES:
* Contento Elena
* Vaca Lisseth
* Valle Estefanía
D.M.Q. 01/02/2013

PRÁCTICA No. 7
INFORME DE LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA GENERAL

1.TEMA: PREPARACIÓN MASTER MIX SYBR GREEN

2. OBJETIVOS:
* Conocer de forma práctica la técnica de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa).
* Evaluar la eficiencia y especificidad de la técnica PCR en tiempo real.
* Conocer los reactivos y las concentraciones empleadas para realizar PCR en tiempo real, y la importancia que tienen cada uno de estos.

3. INTRODUCCIÓN:

PCR atiempo real (PCRrt)

La reacción en cadena de la polimerasa, cuyas iniciales en inglés son PCR ("polymerase chain reaction"), es una técnica que fue desarrollada por Kary Mullis a mediados de los años 80. Con esta metodología se pueden producir en el laboratorio múltiples copias de un fragmento de ADN específico, incluso en presencia de millones de otras moléculas de ADN.
Ventajas:
*Rapidez
* Alta sensibilidad
* Alta especificidad

Marcadores de peso moleculares

PCR Convencional
Master Mix para: PCR Cuantitativa
PCR Cuantitativa SYBR

Preparación de la mezcla para la PCR

Los reactivos fundamentales para la PCR son agua, el tampón de reacción, una ADN polimerasa termoestable, cebadores oligonucleotídicos, desoxinucleótidos (dNTP) y ADN molde(diana), así como iones de magnesio (Mg2+).

Aplicaciones:

* Cuantificación de ácidos nucleicos (AQ).
* Diagnóstico clínico
* Monitoreo y Evaluación de terapia
* Detección de cepas resistentes a antibióticos y mutaciones puntuales
* Filiación humana
* Medicina Forense
* Pedigrí animal
* Control de calidad
* Estudio de la expresión de los genes (RQ oRT-PCRrt).
* Discriminación alélica o detección de variantes genéticas que afecten a un único nucleótido (single nucleotide polymorphism, SNP).
* Establecimiento de la presencia o ausencia de secuencias de ácidos nucleicos específicas y de particular interés (Plus/Minus Assays).

SYBR Green:

* Absorbe a 480 nm, y emite a 520 nm.
Desventaja:
* Se une a cualquier DNA de doble cadena deforma inespecífica (dímeros de primers y/o productos inespecíficos).

Agentes intercalantes

Son fluorocromos que aumentan notablemente la emisión de fluorescencia cuando se unen a ADN de doble hélice. El más empleado en PCR a tiempo real es el SYBR Green I .
El incremento de ADN en cada ciclo se refleja en un aumento proporcional de la fluorescencia emitida.
Este sistema de deteccióntiene la ventaja de que la optimización de las condiciones de la reacción es muy fácil y además, es más barato que las sondas específicas. El principal inconveniente de los agentes intercalantes es su baja especificidad, debido a que se unen de manera indistinta a productos generados inespecíficamente o a dímeros de cebadores, muy frecuentes en la PCR. Para mejorar la especificidad se deben emplearcondiciones de reacción óptimas y una selección cuidadosa de los cebadores para disminuir el riesgo de formación de dímeros. Además, es recomendable iniciar la reacción de síntesis de ADN a temperaturas elevadas ( h o t-start PCR), lo cual disminuye de forma notable el riesgo de amplificaciones inespecíficas.
Se utilizan principalmente dos tipos de fluorocromos. Un método muy utilizado por sumenor coste es el emplear fluoróforos que se unen a DNA de doble cadena, como SYBR Green. El SYBR Green se une inespecíficamente al DNA de doble cadena y produce fluorescencia. Estos fluorocromos no son específicos ya que se unen a toda molécula de DNA de doble cadena, incluyendo los dímeros de primer. Otra alternativa, más cara pero recomendada cuando hay problemas de especificidad, es el uso de...