preparacion de frotis

PRACTICA No. 1
PREPARACION DE FROTIS, TINCION SIMPLE, DIFERENCIAL Y DE ENDOESPORAS
OBJETIVO:
Que el alumno aprenda las técnicas de preparación de frotis, de fijación y coloración más utilizadas en el estudio microscópico de cultivos bacterianos, obtenidos de medios sólidos y líquidos. Que identifique las principales formas bacterianas y la importancia de las tinciones simples en lacaracterización morfológica de estos microorganismos.
Que el estudiante clasifique algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas de acuerdo a la tinción de Gram. Que observe estructuras bacterianas especiales, como las endosporas y cápsulas con tinciones selectivas. Que comprenda la importancia que tienen estas tinciones para la caracterización e identificación de las bacterias.INTRODUCCION:
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia dedeterminados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
Los microorganismos se pueden teñir satisfactoriamente mediante tinción simple, esto es, utilizando un solo colorante.
Los métodos de tinción diferencial clasifican a las bacterias en grupos diferentes según sus propiedades de tinción.
Se han desarrolladonumerosos métodos de tinción para estudiar estructuras bacterianas específicas con el microscopio óptico. Las endoesporas no se tiñen bien con la mayoría de los colorantes, pero una vez teñidas, resisten inmensamente la decoloración.
MUESTRAS:
Escherichia coli
Basillus subtilis
Micrococcus

MATERIAL:
1 mechero
1 asa de siembra
6 portaobjetos
Pizeta con agua destilada
EQUIPO:
Microscopioóptico
Parrilla de calentamiento
REACTIVOS:
Azul de metileno alcalino
Alcohol etílico al 70%
Fenol al 2%
Safranina
Lugol
Verde de malaquita
TECNICAS:
Tinción simple
Tinción diferencial de gram
Tinción Schaeffer-Fulton endospora
PROCEDIMIENTO:
TINCION SIMPLE:
1. Cubrir el frotis con 2 gotas de azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto.
2. Eliminar el exceso de colorante conlavado suave al agua corriente o con la ayuda de la piceta con agua destilada.
3. Dejar secaral aire
TINCION DIFERENCIAL:
1. Marcar un portaobjetos con el nombre del microorganismo a observar. Cada equipo deberá hacer obligatoriamente cinco preparaciones (una preparación por persona): una de E. coli, una de Bacillus sp., una de Serratia marcescens, una de Klebsiella pneumoniae y alguna dePseudomonas.
2. Elaborar preparaciones fijas de las bacterias a observar.
3. Añadir 1 ó 2 gotas de cristal violeta a la preparación, hasta que se cubra por completo. Dejar actuar el colorante durante 1 minuto.
4. Una vez transcurrido el tiempo, lavar la preparación con la pízeta sobre el recipiente de plástico para tinciones.
5. Agregar 1 ó 2 gotas de solución lugol a la preparación, y dejar actuar 1minuto. Transcurrido el tiempo, lava.
6. Con cuidado, añadir gota a gota el alcohol-acetona lavando la preparación durante 10 segundos.
7. Añadir el colorante de contraste, safranina (1 ó 2 gotas) y dejar actuar durante 30 segundos. Lava con la pizeta.
8. Dejar secar al aire y observar al microscopio, siguiendo la técnica de la práctica anterior para enfocar correctamente. Observar con elobjetivo de inmersión.

TINCION ENDOESPORAS:
Colocar un pequeño trozo de papel filtro sobre el frotis de Bacillus subtilk.
b) Agregar verde de malaquita sobre el papel filtro de tal manera que cubra toda la preparación.
c) Colocar el portaobjetos sobre un vaso de precipitados con agua en ebullición.
d) Dejar durante 5 minutos evitando que se seque el colorante (agregar un poco más sí es...